mRNA稳定性调控在糖尿病肾病系膜细胞形态功能异常中的作用及干预

系膜细胞功能蛋白高表达是糖尿病状态下系膜细胞形态功能异常发生发展的重要原因。相关研究提示，糖尿病状态下系膜细胞功能蛋白高表达过程可能存在mRNA稳定性调控异常。人抗原R（HuR）是一种真核细胞广泛表达的RNA结合蛋白，可通过与靶基因mRNA结合增加后者稳定性。目前已知，HuR参与多种细胞生物学过程的调节，如细胞周期调控、细胞外基质合成、炎症介质及生长因子的合成等。课题拟采用细胞培养及动物模型的方法，首先观察糖尿病状态下系膜细胞HuR表达及活性的改变，进而通过RNA干扰的方法观察HuR与糖尿病环境下系膜细胞功能蛋白高表达之间的关系。在此基础上，进一步观察AMPK激活剂能否通过抑制HuR，对糖尿病状态下系膜细胞功能蛋白高表达具有抑制效应。通过本课题的研究，不仅可以帮助我们深化糖尿病肾病发病机制的认识，同时也为临床干预糖尿病肾病寻找到新的靶点。

背景 系膜细胞形态功能异常是糖尿病肾病(DN)早期重要病理生理变化。血管紧张素Ⅱ在DN中亦有较高表达，并在糖尿病发展过程中有重要促进作用。细胞周期蛋白cyclinD1是系膜细胞增殖的效应蛋白。mRNA结合蛋白HuR与效应蛋白mRNA结合，增强mRNA稳定性，增加蛋白表达，进一步发挥病理生理作用。本课题模拟糖尿病状态并观察HuR与靶基因mRNA结合后增加稳定性，探讨在DN过程中转录后调控机制。方法：免疫组织化学检测糖尿病大鼠肾小球系膜细胞HuR表达；体外培养人系膜细胞并使用流式细胞仪、Westernblot、RT-PCR、免疫沉淀法以及RNA干扰方法观察HuR与相关功能蛋白变化水平。结果：（1）体内部分：正常大鼠HuR存在于细胞核中，糖尿病大鼠肾活检组织中可见HuR在系膜细胞及小管上皮细胞胞浆中表达增多；（2）体外部分：系膜细胞在高糖刺激下HuR迁移不及AngII明显，在加入AngII时HuR发生由胞核至胞浆明显迁移，细胞免疫组化及westernblot显示在6h时达到最大值，24h恢复正常与0h差异无统计学意义；（3）qRT-PCR显示系膜细胞中cyclinD1mRNA经AngII刺激后在24h升高不明显，而蛋白水平增加显著。正常细胞cyclinD1mRNA半衰期为9.13h，经AngII刺激后达20.34h；（4）流式细胞仪显示AngII刺激24h后G1期较正常组显著降低。24hS+G2-M期较0h显著升高，表明AngⅡ对人肾脏系膜细胞具有明显促增殖效应；（5）系膜细胞AngII刺激6h后，用免疫沉淀法检测cyclin D1 mRNAs与HuR蛋白的结合能力显著增强；（6）HuR干扰后，HuR蛋白水平显著减少。cyclinD1mRNA未有明显变化，但蛋白水平显著降低。与阴性对照组相比，siHuR后系膜细胞对于G0/G1期细胞数目有所恢复。HuR siRNA对于延迟细胞G0/G1期的活动有重要影响。结论：糖尿病状态下HuR在系膜胞浆表达显著升高，体外实验中呈现出一过性现象，并与基质相关蛋白相互作用，增强转录后调控以及病理蛋白表达，加速DN进展。通过siHuR显著抑制HuR表达，从而抑制DN早期系膜细胞增殖病理过程。不仅深化了对DN病生机制的认识，更为临床干预探索了新的靶点。