聚乙烯亚胺联合超声造影微泡实现多基因靶向性转导的研究

肿瘤基因治疗中基因转导是其关键，由于病毒载体制备复杂，产能有限和本身的安全性等问题需要开发更安全有效的非病毒载体。单纯使用物理或化学方法建立的非病毒转导方法存在转导效率、靶向性低和转导过程对组织、细胞的损伤等。我们根据PEI化学性基因转导研究进展和氟碳脂质超声造影微泡靶向物理学基因转导的突破，将氟碳脂质超声造影微泡、PEI及P53C-IRES-survivin-siRNA DNA片段三者结合制备氟碳脂质超声造影微泡包被的PEI/DNA复合物，试图通过氟碳脂质超声造影微泡来修饰PEI/DNA复合物阳离子基团的暴露，减低PEI/DNA复合物潜在毒性和增强体内的稳定性，实现非病毒载体转导的靶向性和高效性问题。因此本课题是物理和化学转导的巧妙结合，赋予了基因转导靶向同时，利用化学和物理转导的协同作用来提高非病毒载体转导效率，为今后超声领域应用该脂质体超声造影剂进行恶性肿瘤的基因治疗奠定实验基础。

研究背景：基因转导是基因治疗的关键。由于病毒载体制备复杂,产能有限和本身的安全性等问题表明需要开发更安全有效的非病毒载体。单纯使用物理或化学方法建立的非病毒转导方法，存在转导效率、靶向性低等问题。本课题根据近年来聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)化学性基因转导研究进展，和超声造影微泡靶向物理学基因转导的突破，将两者结合制备超声造影微泡包被的PEI/DNA复合物，通过超声造影微泡来修饰PEI/P53复合物，并通过超声能量微泡释放PEI/DNA复合物，减少其阳离子基团的暴露，减低潜在毒性，增强体内的稳定性,从而提高非病毒载体转导的靶向性和高效性。.主要研究内容：合成p53(C22)Ant 片段，制备超声造影微泡包被的PEI/DNA复合物，并进行靶向微泡的理化性质测定和体外生物学活性检测。制备小鼠H22腹水瘤模型，分成A组：PBS组；B组：pEGFP质粒组；C组：pEGFP质粒+ MB+US组；D组：pEGFP+PEI组；E组：pEGFP质粒+PEI+US组；F组：PEI+pEGFP+MB+US组，进行聚乙烯亚胺（PEI）联合载基因超声造影微泡对小鼠腹水瘤治疗效果的研究。.结果及数据：成功制得获得117bp的p53(C22)Ant基因片段，该值与理论值（加上一个终止密码子(3bp)，两个限制性内切酶识别序列(12bp)和两个引物内互补序列(12bp)相符。制备的超声造影微泡包被的PEI/DNA复合物，结果显示所制备的融合微泡分布均匀，平均粒径大约2.2μm。荧光显微镜观察目的基因在肿瘤细胞内显影：空白对照组、单纯质粒组细胞内均无明显可见的荧光显影；PEI/DNA+微泡+US组、PEI/DNA组可见绿色荧光显影，PEI／DNA+微泡+US组绿色荧光最强。观察各组小鼠生存情况，发现各组小鼠腹水量差异及平均生存时间具有统计学意义。免疫组化比较各组小鼠腹水肿瘤细胞的P53蛋白表达情况，F组表达率最高。流式细胞仪检测各组小鼠腹水肿瘤细胞的凋亡情况，F组凋亡率最高。.科学意义：本课题赋予了基因转导靶向的同时，利用化学和物理转导的协同来提高非病毒载体转导效率，为应用脂质体超声造影剂进行肝癌腹水瘤的基因治疗奠定了实验基础。