连接肽影响NSP杂合酶结构与特性的机理研究

鉴于连接肽结构对融合蛋白中亲本结构和功能影响很大；各特定蛋白质之间的融合需采用其最佳连接肽。本研究在分析木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶蛋白质结构的基础上，设计不同类型的连接肽，其一以 [(GGGGS)n，n=1-6] 作为首选，同时运用LINKER辅助设计氨基酸组成性质相似而长度不同的柔性连接肽，其二为不同长度的[(EAAAK)n，n=1-6]刚性连接肽，其三为在蛋白质结构数据库(PDB)中搜寻到的候选天然连接肽, 构建和表达系列NSP酶融合基因，并分析其功能和特性；最后根据对典型杂合酶圆二色谱测定和同源建模所得结构分析结果，阐明连接肽与杂合酶蛋白质结构和特性的关系，以期获得高活性且特性优的双功能NSP杂合酶及所用连接肽的结构特征。研究结果将为双(多)功能NSP杂合酶的构建提供基础和方法指导，为饲用酶研究和应用提供新的发展方向，同时为其它不同类型蛋白质间的融合提供理论依据和技术路线。

本研究采用不同的连接肽利用SOE技术构建了5种双功能NSP杂合基因，并在大肠杆菌中表达，纯化表达产物后进行酶特性的分析，以研究不同连接肽对NSP杂合酶结构的影响。主要结果如下：.1. 双功能NSP杂合基因的构建及表达.设计了三个连接肽L34，L56和L78，采用SOE法构建了gx-12、gx-34、gx-56和gx-78 4个NSP杂合酶基因。其中gx-12由葡聚糖酶基因glu和木聚糖酶b12首尾直接连接而成。测序结果表明gx-12、gx-34、gx-56和gx-78全长分别为1293bp、1329bp、1338bp和1362bp。这些杂合基因成功地在大肠杆菌BL21中获得了表达， SDS-PAGE显示，5个NSP酶杂合基因重组表达载体的工程菌分别在45kD左右出现了一条特异性条带。.2. NSP杂合酶的纯化、特性比较和结构分析.通过硫酸铵分级沉淀，G-25凝胶过滤脱盐，透析浓缩和阳离子交换层析等步骤，分离纯化了2个亲本酶和5个杂合酶。酶特性分析表明，GX-34和GX-56仅有葡聚糖酶活性而无木聚糖酶活性，GX-12、GX-78和GX-endo均有双功能酶活性。5个杂合酶葡聚糖酶部分的最适温度和热稳定性均降低，耐碱范围变宽，Km变小。结构分析发现，这与杂合酶中葡聚糖酶部分的催化中心位点的结构发生了变化、氢键丢失及原子间碰撞量增加等有关。.NSP杂合酶对于木聚糖酶部分的影响较大，GX-34和GX-56木聚糖酶活力丧失，GX-endo、GX-12和GX-78的酶活力和最适温度明显降低；GX-78的热稳定性明显低于GX-12和GX-endo，而后两者与亲本（B12）接近；GX-12、GX-78和GX-endo的Km均大于亲本。结构分析表明以上变化主要与底物结合中心的结构变化较大及催化位点E78产生较多新的碰撞有关。.综上所述，连接肽对于双功能NSP杂合酶的构建十分重要。.