多模块糖苷水解酶模块间连接肽调控酶空间构象的机制研究

Multimodular glycoside hydrolase contains multiple binding modules and catalytic domains which are connected by linker peptide. The linkers and terminal disordered residues have no single and stable 3D structures, which can be designated as intrinsically disordered proteins (IDPs). Till now, the roles for linker peptides and terminal disordered residues (amino acid composition, length, and stiffness) on cellulase properties (interdomain interaction, thermostability, conformation, and binding between enzyme and substrate) have not yet been determined. In this project, we will investigate the transition conformation of IDPs in solution by thermodynamic analysis, interdomain interaction determination, small angle x-ray scattering, single molecule fluorescence resonance energy transfer, and NMR. The relationship between IDPs and enzymatic properties of glycoside hydrolases (thermostability, substrate specificity, binding, sliding, and degrading between enzyme and substrate, and interdomain interaction) will be investigated. IDPs are optimized during enzyme evolution, which give us a clue on the function of IDPs. The relationship between the sequence and function of IDPs will be established, which will lay the foundation for designing and constructing industrial catalysts for efficient cellulose degradation.

多模块糖苷水解酶一般由催化结构域与碳水化合物结合模块通过一段连接肽（linker）序列相连。糖苷水解酶的Linker及蛋白末端无序残基通常不具备稳定的3D结构，属于固有无序蛋白(Intrinsically disordered proteins, IDPs)。到目前为止，糖苷水解酶的IDPs氨基酸组成、长度和刚度对酶的热适应性进化、催化效率、酶与底物结合的影响，尚不清楚。本项目拟通过linker置换、关键氨基酸突变等，构建多模块糖苷水解酶突变体，运用小角X射线散射、单分子荧光、核磁共振等方法研究糖苷水解酶中linker在溶液中的瞬时构象变化，解析其对糖苷水解酶热稳定性、催化效率、酶与底物结合、持续性等的影响，阐明linker在酶构象平衡过程中作用。通过研究多模块糖苷水解酶IDPs在蛋白热适应性进化过程中的氨基酸组成优化机制，建立IDPs序列与功能之间的关系，为体外重构糖苷水解酶奠定基础。

多模块纤维素酶通常包含催化模块和碳水化合物结合模块，模块之间通过一段连接肽（linker）相连。Linker通常不具备稳定3D结构，属于固有无序蛋白。以GH9 家族多模块持续性内切纤维素酶为例，催化模块是酶持续性水解的驱动力来源，而Linker对酶的热适应性、催化效率及底物结合效率等同样重要。本项目首先针对GH9多模块纤维素酶的持续性驱动力来源，以CcCel9A为研究对象，通过同源建模与底物对接获得活性中心中与底物相互作用的氨基酸位点，并分成产物释放位点 Glc(−4~−1)和底物结合位点 Glc(+1/+2)。通过对各亚位点进行点突变及酶学性质表征，结合计算模拟，揭示了GH9催化结构域的持续性机制，首次提出“Wirewalking (滑轮 )”模型。该模型中Glc(+1/+2)主要负责破坏纤维素单链与 CBM结合的氢键，而 Glc(−4~−1)负责拉动剥离出的单链，两部分相互协同，使酶分子在底物表面持续滑动。其次，针对模块间连接肽的功能，以CelA为研究对象，对连接CBM3c和CBM3b的linker进行缺失、延长及置换等改造，并进行酶学表征。结果表明，Linker对保证CBM3b和GH9+CBM3c之间的协同性，维持酶的持续性是必需的，Linker长度和刚柔性改造影响酶的持续性。通过小角度X射线散射及单分子荧光技术分析了Linker构象信息，表明Linker在溶液中是以相对伸展的构象存在，但同时也存在少量压缩态的构象。以上研究表明，一个相对刚性的linker可通过伸展和相对压缩两种构象，协调CBM3b 和GH9+CBM3c 之间的协同性，使酶能够持续性降解底物。本项目的研究有助于认识多模块持续性纤维素酶在进化中的巧妙性，为高效酶的定向改造和未来高效定制工业酶催化剂平台的建立提供理论支撑。