猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白（nsp）1α和nsp11抑制β干扰素转录的分子机理研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) induced immunosuppression and persistent infection ，so it caused huge economic loss for the swine industry. Our previous study has found that PRRSV nsp1α and nsp11 inhibited IFN-β production, however, the mechanism of that is not clear. So the aim of the present project is to identify the proteins that interact with PRRSV nsp1αor with PRRSV nsp11 by the methods co-immunoprecipitation, SDS-PAGE，protein silver staining and mass spectrometry sequencing or the methods the yeast two-hybrid and the DNA sequencing. And then, using over-expression and RNA interference of the identified proteins to exploring the functions of this protein to the signal transduction of the transcription of IFN-β and the effect of this protein to the PRRSV virulence. The implementation of this project is useful to understand the mechanism that PRRSV inhibited the immune response and also useful to offer the potent target for exploring PRRSV vaccine and screening new drug for anti-PRRSV.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起机体免疫抑制和持续性感染，给养猪业造成损失巨大。我们前期实验证明PRRSV 非结构蛋白（nsp）1α与nsp11 抑制β干扰素转录，但其机理还不清楚。本项目拟通过免疫共沉淀、SDS-PAGE电泳、银染和质谱测序以及酵母双杂交方法确定与nsp1α和nsp11相互作用的蛋白质，然后用Pull down和蛋白共定位确认与nsp1α或nsp11相互作用的蛋白。再利用蛋白质过表达和RNA干扰探讨该蛋白在β干扰素转录信号通路中的作用和该蛋白对PRRSV毒力的影响。该项目的实施有助于理解PRRSV抑制机体免疫反应的机理，并为开发PRRSV疫苗和筛选抗PRRSV药物提供潜在靶点。

I型干扰素（IFN-α和IFN-β）是机体重要的抗病毒蛋白，我们前期实验证明PRRSV及其非结构蛋白nsp1α和nsp11抑制β干扰素转录，所以本项目首先探讨了抑制I型干扰素的转录是否为PRRSV免疫逃逸的重要原因。不同剂量PRRSV感染前已加入重组IFN-β的MARC-145细胞、不同剂量PRRSV感染4小时后再加入重组IFN-β的MARC-145细胞和不同剂量PRRSV感染8小时后再加入重组IFN-β的MARC-145细胞在病毒感染后120小时均不发生细胞病变；而对于不同剂量PRRSV感染后24小时再加入重组IFN-β的MARC-145细胞，仅高剂量感染PRRSV的细胞, 发生了细胞病变。这表明抑制I型干扰素的转录可能是RRSV免疫逃逸的重要原因。然后本项目围绕PRRSV抑制I型干扰素的转录这一核心科学问题，发现PRRSV上调的miRNA-373通过靶向I型干扰素转录信号蛋白IRAK1、IRAK4、IRF1以及NFIA和NFIB而抑制I型干扰素的转录，从而促进病毒的复制，并首次发现NFIA和NFIB不仅是I型干扰素的转录因子而且是拮抗PRRSV复制的宿主内源性蛋白。接下来，以PRRSV的非结构蛋白nsp1α和nsp11为研究重点，通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验，共发现了4个与nsp1α相互作用的宿主蛋白和2个与nsp11相互作用的宿主蛋白，但siRNA实验表明这些蛋白均不参与I型干扰素的转录。另外，也发现nsp1α和nsp11具有拮抗RNAi先天性免疫和拮抗NLRP3介导的炎症反应，与此同时，还发现了过表达的nsp1α和nsp11均具有促进PRRSV在MARC-145细胞中复制的功能。本项目的实施，不仅在PRRSV抑制I型干扰素转录的分子机理研究中取得重要突破，即发现了NFIA和NFIB是拮抗PRRSV复制的细胞蛋白，这为通过调控NFIA和NFIB表达进而来防控PRRSV提供了理论指导，而且通过对nsp1α和nsp11的系统研究，确定了nsp1α和nsp11是PRRSV拮抗宿主先天性免疫的重要病毒蛋白，为后期将nsp1α和nsp11作为药物筛选靶点等来防控PRRSV提供了理论指导。