细胞NF-κB和IRF7信号转导途径介导的固有免疫反应对NDV复制影响的研究

Many scientists have payed close attention to the infection mechanism of causing disease by Newcastle disease virus(NDV) over recent years. But there is little information in the papers about the effect of the host innate immunity from the change of the signal transduction pathways to NDV infection mechanism of causing disease.This research will study the effect of NDV replication by various types of NF-κB and IRF7 signal transduction pathways after NDV infecting CEF by many technologies including qPCR,RNAi,immunofluorescence assay,electrophoretic mobility shift assay and Pull down et al. By combining Ch-IRF7-Luc, Ch-NF-κB-Luc and Ch-STAT1-Luc reporter genes,to study of NDV V/W proteins on the NF-κB and IRF7 signal transduction pathway regulation and on NDV replication from the over-expression of NDV V / W protein and V/W gene deletion NDV strains infection of host.The accomplishment of this research will establish theoretical foundation for innate immunity interfering with NDV replication and the mechanism of causing a disease of NDV escaping host innate immunity.It will provide the guidance of a scientific theory for the research of virus evolution, vaccine development and clinical application.

近年来，新城疫病毒（NDV)感染致病机制引起科学家的广泛关注，但是从宿主信号通路变化而诱导的固有免疫反应对NDV感染致病机制的研究较少。本项目通过应用qPCR、RNAi、激光共聚焦扫描、凝胶阻滞和Pull down等技术研究病毒感染后细胞NF-κB和IRF7信号通路的变化及该变化对NDV复制的影响。构建NDV V和W基因真核过表达系统和应用反向遗传技术获得V/W基因缺失NDV 毒株，结合构建的报告基因研究NDV V/W蛋白对细胞NF-κB和IRF7信号通路的调控及对NDV复制的影响。在此基础上，对NDV V/W C末端进行分段，应用Pull down 和点突变技术确定影响NF-κB和IRF7信号通路的NDV V/W C末端核心区域序列和关键核苷酸。本项目的实施为宿主固有免疫反应影响NDV的复制和NDV逃逸宿主固有免疫反应的致病机制奠定理论基础，为病毒进化研究以及疫苗研发提供科学的指导依据。

病毒感染宿主后能够诱导天然免疫反应，同时病毒通过编码蛋白来抑制宿主的天然免疫反应。干扰素是动物机体抵抗病毒感染的重要免疫分子，前期研究表明新城疫病毒非结构蛋白V可以通过拮抗宿主干扰素的产生增强自身复制，但其中的具体机制有待探究。本研究发现新城疫病毒强弱毒株感染CEF细胞后均能上调IRF7、p65的表达及核移位，强毒诱导IFN的水平低于弱毒，提示强毒可能存在更强的抑制宿主天然免疫的机制。构建新城疫病毒强毒GM株的V蛋白真核表达载体，转染DF-1细胞后测定IFN-β的表达，结果表明GM株的V蛋白能够有效抑制poly(I:C)诱导的IFNβ的产生。通过荧光素酶报告基因实验研究过表达V蛋白后IRF7、p65报告基因活性，发现V蛋白能够有效抑制IRF7、p65的表达。为了研究V蛋白介导IRF7、p65通路抑制干扰素的，分段过表达V蛋白进行测定IRF7、p65表达的影响和对宿主细胞干扰素产生的影响，结果显示V蛋白羧基端能够有效抑制IRF7、p65报告基因活性和下游IFN的产生。将V蛋白各片段转染DF-1细胞后接种NDV，检测病毒滴度变化，结果显示V蛋白及V蛋白羧基端能够增强病毒复制。综上所示，本研究表明新城疫病毒强毒株非结构蛋白V能够通过抑制宿主转录因子IRF7、p65的表达从而拮抗下游干扰素的产生，V蛋白抑制IRF7、p65主要结构域存在于其氨基端，V蛋白通过抑制宿主IRF7、p65拮抗干扰素，降低宿主的抗病毒反应，增强了病毒的复制能力。由于近年来的研究越来越多地证明, 病毒非结构蛋白可以通过干扰素以外的其他途径影响宿主细胞免疫和生理生化行为来促进病毒自身复制。本研究通过构建两套V蛋白的高效真核表达系统，应用Co-IP试验筛选出11种与V蛋白发生互作的宿主蛋白分子，为研究的下一步深入提供了新的思路和方向。项目在研期间发表了13篇SCI论文，培养了了3名博士研究生，目前有2名在读博士和1名在读硕士继续进行后续研究工作。