基于免疫受体-NF-κB信号转导途径的三角帆蚌多糖免疫调节活性的分子机制研究

Hyriopsis cumingii, natural distributing in China only, is edible and may play a role in health-care. Immunomodulatory function of natural polysaccharides is mediated by polysaccharides receptor on immunocyte surface. Signal transduction pathway of immunologic receptor-nuclear factor kappa B (NF-κB) is one of the modulating mechanisms of polysaccharides on immunocyte function. Based on our preliminary study, immunomodulatory molecular mechanism of polysaccharides from H. cumingii will be studied by animal and cell experiments in signal transduction pathway of immunologic receptor-NF-κB, phagocytosis, chemotaxis and signaling molecules of immunocytes. In peritoneal macrophage and spleen dendritic cell, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and real time fluorescent quantitative-PCR (FQ-PCR) will be used to detect messenger RNA (mRNA) expression of immunologic receptor, NF-κB and signaling molecules of immunocytes. Immunohistochemisty and Western blotting will be used to detect protein expression of immunologic receptor, NF-κB and signaling molecules of immunocytes. Flow cytometry will be used to detect immunocyte phagocytosis and cluster of differentiation antigen. Enzyme-linked immunoadsordent assay (ELISA) will be used to detect cytokine. Practice of this project may provide supports of science and technology for developing and utilizing bioactive polysaccharides of H. cumingii.

三角帆蚌为我国特有物种，具有食用和营养保健作用。天然多糖发挥免疫调节作用是通过细胞表面的多糖受体介导完成的，免疫受体-核因子κB（NF-κB）信号途径是多糖影响免疫细胞功能的主要机制之一。本项目以三角帆蚌蚌肉为材料，在我们前期研究的基础上，通过动物模型实验和细胞模型实验，以小鼠腹腔巨噬细胞、脾树突状细胞为研究对象，运用反转录PCR、实时荧光定量PCR技术检测免疫受体、NF-κB及相关信号分子的信息RNA表达量，免疫组化、免疫印迹技术检测免疫受体、NF-κB及相关信号分子的蛋白含量，流式细胞仪检测免疫细胞吞噬活性、抗原分化群分子，酶联免疫吸附技术检测细胞因子的含量，从免疫受体-NF-κB信号通路及其下游免疫细胞的吞噬活性、趋化活性、分泌的信号分子等方面，从细胞信号通路和分子水平研究探讨三角帆蚌多糖免疫调节活性的作用机理，为开发应用三角帆蚌活性多糖、充分利用三角帆蚌资源提供科学依据和技术基础。

三角帆蚌为我国特有物种，具有食用和营养保健作用。本课题以三角帆蚌蚌肉为材料，初步研究了三角帆蚌多糖对免疫受体-NF-κB 信号通路的调节作用、对此信号通路下游免疫细胞吞噬活性、趋化活性及免疫信号分子的调节作用。结果表明：三角帆蚌粗多糖能够促进鼠脾脏中TLR4、MR1、NF-κB、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、iNOS、CD4、CD8基因的表达及TLR4、MR1、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、CD4、CD8基因mRNA的合成，促进鼠血清中TLR4、MR1、TNF-α基因的表达，对鼠脾脏中IL-10基因的表达及mRNA的合成、血清中IL-10基因的表达有抑制作用，对鼠脾脏中cAMP的合成有抑制作用，对鼠血清中cGMP的合成有促进作用，且存在剂量效应关系。三角帆蚌粗多糖及其纯化组分（HCPS-1、HCPS-2和HCPS-3）能够促进鼠腹腔巨噬细胞MR1、NF-κB、iNOS基因的表达，增强鼠腹腔巨噬细胞吞噬SRBC的吞噬能力，增强鼠腹腔巨噬细胞趋向MCP-1的趋化性，且有剂量效应关系。. 项目的实施，从免疫受体-NF-κB 信号通路及其下游免疫细胞的吞噬活性、趋化活性、免疫信号分子等方面，从细胞信号通路和分子水平初步阐明了三角帆蚌多糖免疫调节活性的作用机理。即免疫细胞表面的TLR4可作为三角帆蚌多糖的模式识别受体，引起胞内NF-κB的活化，被激活的NF-κB再刺激细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达同时抑制细胞因子IL-10的表达，进而增强免疫细胞吞噬SRBC的吞噬能力、趋向MCP-1的趋化性。此外，三角帆蚌多糖还可刺激抗原分化蛋白CD4、CD8的表达，进而促进T淋巴细胞向CD4+、CD8+T细胞的分化；刺激iNOS的表达，进而促进气体信号分子NO的生成；刺激cGMP级联、同时抑制cAMP级联，进而促进细胞第二信使的信号传导作用。这些都可以增强机体的免疫作用。项目的研究成果可以为开发应用三角帆蚌活性多糖、充分利用三角帆蚌蚌肉资源提供理论依据和支持，为进一步研究三角帆蚌多糖生物活性的构效关系奠定基础，为三角帆蚌生物活性物质的研究、为贝类多糖的研究积累一些资料。