囊泡谷氨酸转运体在谷氨酸耳蜗毒性机制中的作用

An over-release of glutamate could result in injury in the cochlea ascribed to various ototoxicity factors, yet the exact mechanism remains unclear. Our pervious study demonstrated that Glu could take impairment on SGNs, and salicylate led to damage in the SGNs and induced a high expression of Glu as well as VGLUTs, so we proposed that VGLUTs intervened with Glu releasing participated in Glu-induced ototoxicity. In the present research, we aimed to investigate the alteration of VGLUTs along with GLAST, GLT-1 and EAAC in the cochlea disposed with salicylate with the techniques of electrophysiology, morphology, molecular biology and biochemistry to manifest which transporter play more important role in the balance of Glu in the inner ear. In addition, a specific inhibitor administered would be used to evaluate the degree of damage caused by Glu in the cochlea, with an expectation to uncover the major principle of Glu-induced ototoxicity.

谷氨酸(Glu)过度释放与多种原因造成的耳蜗损伤密切相关，但其作用机制不明。我们通过前期国自然项目研究认为：Glu可致耳蜗内毛细胞、突触和螺旋神经元（SGN）损伤；现预实验提示：水杨酸可诱导Glu及囊泡谷氨酸转运体（VGLUTs）在SGN中的表达增高，进而造成SGN损伤。提示：VGLUTs参与谷氨酸耳蜗毒性机制。在本研究中，我们将采用电生理、形态学、分子生物学、生物化学等学科技术，以水杨酸为工具药，探讨VGLUTs及谷氨酸相关转运体（GLAST﹑GLT-1﹑EAAC）在耳蜗中的定位、半定量、转录水平、蛋白水平及超微表达的改变，从而明确对维持耳蜗GLu平衡起主要作用的转运体类型；并且通过给予VGLUTs抑制剂来检测谷氨酸相关耳蜗毒性指标（毛细胞及SGN形态、数目，凋亡相关因子，突触超微结构等）的改变，探讨VGLUTs在谷氨酸耳蜗毒性机制中的作用，以期从突触前干预来拮抗谷氨酸的耳蜗毒性。

谷氨酸是维持正常听觉传导的重要神经递质，但谷氨酸的过度释放也可导致耳蜗损伤，即谷氨酸的兴奋毒性。在突触前，谷氨酸已经受到囊泡谷氨酸转运体的调控。那么，是否可以选择在谷氨酸释放前，就通过调控VGLUTs 的活性，从而抑制谷氨酸耳蜗毒性？VGLUTs 对正常听觉功能的维持起重要作用。但是，① VGLUTs 各亚型在耳蜗中的表达分布目前尚未明确；② 虽然 VGLUTs 各亚型在中枢神经系统的发育变化已有相关研究，且VGLUT3 对早期听觉的形成及螺旋神经元细胞的正常成熟起关键作用，但是其在耳蜗发育期间的变化仍不甚明确；③ 虽然 VGLUT3已被认为与年龄相关性的视神经病变密切相关，且VGLUT3 基因功能缺陷可以导致年龄相关性非综合征型耳聋，但是其在老年性大鼠耳蜗中是否发生改变，如何改变？仍不甚明确。.基于上述问题，在本课题中，我们借助形态学、分子生物学的技术方法，探讨：① VGLUTs 各亚型在正常成年大鼠耳蜗中的表达；② VGLUT3 在大鼠耳蜗发育及老化过程中的表达变化。.根据实验结果，我们发现：① 耳蜗中选择性表达 VGLUT1 及VGLUT3；②VGLUT3 选择性表达在耳蜗内毛细胞，内毛细胞底部的Ⅰ型传入神经末梢，Ⅰ型SGNs 的胞浆中；③ VGLUT3 在内毛细胞及传入神经末梢中的表达形式与在SGNs 细胞中的表达形式不一致，其在内毛细胞中呈均质状表达，而在SGNs 细胞中呈颗粒亮点状表达；④ VGLUT1只表达在SGNs细胞的胞浆中；⑤ VGLUT3在大鼠耳蜗中的表达存在年龄相关性，预示其对耳蜗正常发育及正常听功能起重要作用。.本实验中，我们首次发现 VGLUT3 在耳蜗SGNs 细胞中存在表达，并且只表达在Ⅰ型SGNs 细胞，这是既往研究未曾关注的。其在SGNs 细胞中的表达形式区别于在内毛细胞中的表达形式，这可能将会揭示其不一样的功能。了解VGLUTs 在耳蜗中的时空性变化，进一步揭示VGLUT3 在SGNs 细胞的超微定位表达及其在耳蜗传入突触间的确切功能，明确与其起相互关联的蛋白作用特点，这些已经完成和尚待完成的工作都将为进一步探讨VGLUTs 在听觉系统中的作用，从而为从突触前干预谷氨酸耳蜗毒性奠定良好的理论基础。