转录因子决定囊泡谷氨酸转运体2（VGLUT2）表达的机理研究

To understand the molecular mechanism underlying the development of the nervous system, it is essential to study how transcription factors determine the neurotransmitter phenotypes of neurons. Glutamatergic neurons are the basic excitatory neurons and they can be marked by the expression of Vesicular GLUtamate Transporter 2 (VGLUT2). We have found previously that transcription factor Tlx3 antagonizes Lbx1 to promote the expression of VGLUT2. However, the transcription factors that bind directly to the regulatory regions of VGLUT2 gene and upregulate its expression remain unknown. Recently, we have found that a 1 Kb non-coding region VCR34 of VGLUT2 gene can drive the expression of reporter gene GFP in the developing glutamatergic neurons. After generating the VCR34 knockout mice and examining the phenotypes, we found that VCR34 indeed was required for the expression of VGLUT2. Based on this finding, we will search for the transcription factors that bind to the 1 Kb regulatory element of VGLUT2 and establish how transcription factors from different levels determine the expression of VGLUT2 which is confined in glutamatergic neurons. This study will shed light on understanding how transcription factors determine the neurotransmitter phenotypes and promote the studies related to ES directed differentiation and generation of induced neurons.

转录因子如何决定神经元的递质表型是发育神经生物学研究的重要课题。谷氨酸能神经元为中枢神经系统中基本的兴奋性神经元，囊泡谷氨酸转运体2 (Vesicular GLUtamate Transporter 2, VGLUT2)为其标志性分子。申请人曾报道转录因子Tlx3通过拮抗Lbx1促进谷氨酸能神经元的发育，但直接与VGLUT2基因的调控元件结合并促进其表达的转录因子还不清楚。申请人的前期研究结果找到了VGLUT2的一个组织专一性元件VCR34 （1 Kb）并制备了该调控元件敲除的小鼠，确证该调控元件为VGLUT2表达必需。本项目拟在以往工作的基础上，通过寻找与VCR34 元件结合并正向促进VGLUT2表达的转录因子，阐明不同层次的转录因子如何协调作用决定VGLUT2的表达。这将加深人们对转录因子决定神经元递质表型的认识，并为干细胞的定向神经分化及通过转分化得到特定类型的神经元提供理论依据。

神经递质表型是区分神经元种类的核心标志之一。选择何种递质表型是神经元发育中的重要问题。谷氨酸能神经元是神经系统中基本的兴奋性神经元，它们的神经递质表型如何决定，目前还很不清楚。囊泡谷氨酸转运体 2（VGLUT2）负责将胞浆中的谷氨酸转运到囊泡中分泌，是谷氨酸能神经元的标志分子。本项目主要研究了VGLUT2 的表达调控机理。通过制备 VGLUT2 基因调控序列缺失的敲除小鼠，并分析其表型，发现 VGLUT2 基因非编码区一个 1 Kb 的核苷酸序列 VCR34 为 VGLUT2 在早期胚胎脊髓背角中表达必需。利用 VCR34 作为组织专一性元件制备慢病毒，发现 VCR34 可指导报告基因在中脑与脊髓背部的谷氨酸能神经元中表达。通过制备系列缺失质粒，同时结合荧光素酶活性检测，发现 VCR34 中一段 213 bp 的序列为重要的核心调控序列。采用候选基因的方法，发现与谷氨酸能神经元命运决定相关的转录因子 Brn3a 及 Ngn2 可激活 VCR34 的转录调控活性。这些工作有助于深入理解在发育过程中神经前体细胞如何分化为谷氨酸能神经元，以及从其他类型细胞如何转分化得到谷氨酸能神经元，进而为通过分化或转分化技术高效得到谷氨酸能神经元打下坚实的基础。同时，VGLUT2 的非编码序列 VCR34 可指导报告基因在谷氨酸能神经元中特异表达，也为谷氨酸能神经元中特异过量表达或敲低外源基因的表达提供了一条重要的途径。