胞膜-核膜双靶向定位系统提高超声微泡介导的外源基因转染效率的实验研究

Ultrasound and microbubbles targeted delivery systems (UMTD) are good tissue specificity and micro-toxicity, but there are still bottlenecks that transfection efficiency is low. Sonoporation improves cell membrane permeability, but it is random that cell uptake gene. If the genes can combine with the cell membrane and the nuclear membrane, it can make the genes transfection efficiency to the maximum. So we have designed double target genes of "cell membrane specific antibodiy-gene-nuclear localization signals". Experiments in three parts. By this study establishes a new modified way of gene, it can improve the efficiency of gene transfection mediated by UMTD, and provide new technical support to clinical gene therapy.

超声和微泡定向传递系统（UMTD）虽有良好组织特异性和微毒性，但仍存在转染效率低的瓶颈。UMTD导致的声致孔隙作用虽能增加胞膜通透性，但基因被细胞摄取仍是随机的。如果使基因主动向细胞聚集，并先后与胞膜和核膜结合，就能使基因最大限度地进入细胞。因此我们设计了 "细胞膜特异性抗体-基因-细胞核定位信号"双靶向基因,使基因同时含有胞膜靶向性和胞核趋向性，再联合UMTD作用后增强的细胞内吞作用，促进基因入胞量及入核量，提高基因转染效率。实验分三部分：1 UMTD对胞膜和核膜通透性的影响：确定最佳超声微泡转染条件；2双靶向基因制备:以肽核酸PNA为桥梁制备含有膜特异性抗体和核定位信号肽NLS的双靶向基因；3 UMTD基因转导系统对双靶向基因在不同细胞系中转染效率的影响，检测双靶向基因的入胞与入核效率。藉此研究建立新的基因修饰方式，为提高UMTD介导的基因转染效率和临床基因治疗效果提供新的技术支持。

微泡联合超声辐照系统在基因转染中虽有较好的组织特异性和微毒性，但仍存在转染效率低的瓶颈。微泡联合超声辐照导致的声致孔隙作用虽能增加胞膜通透性，但基因被细胞摄取仍是随机的。为了使基因主动向细胞聚集，并最大限度地进入经微泡联合超声辐照的声致孔隙作用而通透性增加的细胞内，我们设计了 “细胞膜特异性抗体-基因-细胞核定位信号”双靶向基因,使基因同时含有胞膜靶向性和胞核趋向性，促进基因入胞及入核量，提高基因转染效率。实验分三部分：1.研究不同细胞系、不同微泡和超声条件对微泡联合超声辐照介导基因转染效率的影响，研究表明合适的转染条件配伍才能达到较好的基因转染效率，而针对不同细胞配伍的条件却不尽相同；2. 制备Bio-PNA-质粒杂交体、NLS-PNA-质粒杂交体及双靶向的Ab/NLS-PNA-质粒杂交体，通过肽核酸PNA为桥梁将胞膜特异性抗体和核定位信号与质粒DNA相连接；3. 微泡联合超声辐照增强PNA修饰基因的转染效率，研究表明不同修饰的各组质粒DNA的转染效率提高，并且转染后质粒的转录和范围未受影响。结论：通过PNA对基因进行修饰的方式有助于微泡联合超声辐照系统的基因转染效率，而且不会影响基因自身功能，为微泡联合超声辐照系统的基因转染和治疗提供新的技术支持。