超声靶向微泡破裂法介导基因转染的方法学和实用性研究

基因疗法具有很好的应用前景，但寻找有效、安全的非病毒基因转染载体一直是研究工作者探索的目标。超声靶向微泡破裂法(UTMD)是一种有效的介导基因转染的非病毒载体，但在提高转染率、增加稳定性及靶向治疗等方面有待进一步研究。同时核定位信号肽（NLS）和共聚物P85在一定条件下均能促进基因转染。我们通过研制能高效携带相应药物的单层脂质微泡和双层脂质体微泡，首次联合应用NLS、P85和携带这些药物的脂质微泡并辐照超声，从基因转染的入胞、入核及刺激转录等路径入手，来探讨这些非病毒载体在促进基因转染中的协同作用。通过研究HGF基因在小鼠骨骼肌的表达情况对其临床应用价值进行评价；同时应用这种方法来研究p53基因和抗人肝癌单抗HAb18对肝癌动物模型基因治疗和靶向治疗效果进行实用性评价。这一全新的思路将为肿瘤和其他许多可借助基因治疗的疾病寻找一种有效、安全的治疗方法。

超声靶向微泡破裂法(ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)是一种新型的非病毒基因转染方法，可显著提高体内外基因转染，是一种有效的靶向治疗手段。微泡对基因或药物的高效稳定携带以及靶向可达性是提高UTMD基因转染和提高临床应用价值的关键。我们在原有研究的基础上探讨研制能高效携带相应药物的脂质体微泡，联合应用阳离子脂质体、共聚物和阳离子多聚物并辐照超声，来探讨这些非病毒载体在促进基因转染中的协同作用。本研究成功制备了纳米级脂质微泡造影剂(Nano-Liposomal Bubble，NB)、阳离子脂质体（Cationic Liposome，CL）、阳离子脂质微泡造影剂：包括加入DC-Chol制备的CLB（Cationic-Liposomal Bubble，CLB）和加入PEI制备的PNB; 建立了裸小鼠皮下肝癌模型、家兔VX2肝癌模型。NB性质稳定，粒径小，具有良好的体内外显影效果和基因转染效果。NB在家兔正常肝脏实质的显影时长（52.0±4.5）min；在家兔VX2肝癌动脉相呈典型的环状增强；在小鼠肝癌皮下瘤造影呈整体增强。为了检测UTMD的实用性，采用不同参数，结果显示10%的NB协同超声可显著提高pEGFP质粒在HepG2细胞的基因转染率（6.06±0.17）%。为了进一步提高基因转染效率，使用10%的CLB联合超声辐照介导的基因转染效率达到（10.49±1.05）%;加入PEI与单纯NB孵育后辐照超声转染效率为（37.61±0.68）%；而自制PNB超声辐照后体外细胞转染效率达到（42.43±1.77）%，各组的差异具有显著的统计学意义（p＜0.01）。此外，本研究还使用CL或共聚物P85联合UTMD来介导HepG2细胞和小鼠骨骼肌的基因转染效率。UTMD可显著增强CL介导HepG2细胞及小鼠骨骼肌的基因转染率。共聚物P85不但可显著提高质粒DNA在小鼠骨骼肌和HepG2细胞的基因转染，且与超声具有协同作用。本研究显示自制纳米级脂质体超声微泡造影剂显影效果好，粒径小且基于脂质体基础上易被修饰，因此在超声分子影像及基因/药物传递方面具有广阔的应用前景。UTMD及其协同阳离子脂质体、共聚物和阳离子多聚物等非病毒基因转染方法可以显著提高体内外基因转染效率，这些联合方法为基因治疗提供了新思路。