辣椒胞质雄性不育候选相关基因ORF165调控花粉败育的分子机制

Pepper is one of the most important vegetable in the world. The heterosis of pepper is very obvious. Hybrid seeds have been widely used in the field production. But commercial hybrid pepper seed are produced mainly by hand-emasculation and manual pollination. The manual production of hybrid seed increases hybrid seed costs but also difficult to ensure seed purity. Cytoplasmic male sterility (CMS) plants as female parent can overcome those shortcoming. In previous research, using CMS and the maintainer as experimental material, a novel gene ORF165 was selected which expressed in CMS only indicated associated with CMS in pepper by transcriptome sequencing and q-PCR verification. In this research, (1) analysis of the spatiotemporal expression, subcellular localization and interacting proteins to elucidate the basic characteristics of ORF165; (2) clone premotor region, verify the function by GUS staining; and (3) on the base of construction of overexpression carrier with mitochondrial signal peptide and transformed pepper maintainer and obtained transgenic pepper plants, comparative analysis the differences of cytology, immunohistochemistry and transcriptome in the different developing stage of anther among the transgenic pepper plants, pepper CMS line and the maintainer, to analyze the molecular mechanism in pollen abortion regulation. The research results will provide a theoretical basis for clarifying the mechanism of the pepper CMS.

辣椒是一种十分重要的大宗蔬菜。辣椒具有十分显著的杂种优势，当前生产用种大都为杂交种子，但目前杂交种子的生产主要采用母本人工去雄、人工授粉的方式，制种成本高，种子纯度难以保证，利用雄性不育系做母本制种可以克服上述缺点。雄性不育系已应用于辣椒杂交种子的生产，但其雄性不育机理还不清楚。申请者前期对辣椒胞质雄性不育系和同型保持系花药进行转录组测序，筛选到一个与辣椒胞质雄性不育候选相关的基因ORF165，在此基础上研究ORF165时空表达特性、亚细胞定位和互作蛋白等方面，阐明其基本特性；通过克隆启动子区域，利用绿色荧光蛋白GUS染色明确启动子活性；在构建带有线粒体信号肽的过表达载体，转化辣椒保持系获得转基因植株的基础上，研究转基因雄性不育株花药发育过程中在细胞学、免疫组化和转录组等方面与辣椒胞质雄性不育系和同型保持系的差异，解析其调控花粉败育的分子机制。为阐明辣椒胞质雄性不育的分子机理提供理论依据。

辣椒是一种十分重要的大宗蔬菜。辣椒具有十分显著的杂种优势，当前生产用种大都为杂交种子，但目前杂交种子的生产主要采用母本人工去雄、人工授粉的方式，制种成本高，种子纯度难以保证，利用雄性不育系做母本制种可以克服上述缺点。胞质雄性不育系已应用于辣椒杂交种子的生产，但其雄性不育机理还不清楚。申请者前期对辣椒胞质雄性不育系和同型保持系花药进行转录组测序，筛选到一个与辣椒胞质雄性不育候选相关的基因ORF165，在此基础上研究发现ORF165蛋白没有核定位功能，在组织间和花蕾发育过程中稳定表达，推测以转录后调控的方式调控小孢子发育；ORF165蛋白与ATP6蛋白互作，导致ATP 和NADP含量显著降低，影响能量代谢。线粒体基因组测序结果表明ORF165位于COXII下游，并与COXII共表达，与COXII共用同一个启动子。构建线粒体靶向过表达ORF165基因载体，转化保持系，ORF165基因过表达阳性植株开放花朵肉眼未见明显花粉，染色检测发现仅有微量可育花粉，细胞学检测发现转基因阳性雄性植株花粉四分体时期发育异常，转基因不育系花药减数分裂后，由于药室腔的空间不能扩大，四分体被挤压在一起，最终四分体小孢子败育；对转录组测序结果进行分析，发现与携带有ORF165基因的雄性不育自然突变相类似，能量代谢相关通路异常，对ATP和NADP含量检测发现其与胞质雄性不育系含量相近，说明能量供异常。利用病毒诱导的基因沉默技术沉默转基因雄性不育株，得到了VIGS阳性植株。对VIGS阳性植株分析发现：花朵能正常产生花粉，染色检测到有大量可育花粉，细胞学检测发现小孢子能正常发育，转录组分析发现其与保持系相类似，能量代谢通路相关基因的表达趋于正常，对ATP和NADP含量检测发现其与保持系含量相近，说明能量供应趋于正常。为阐明辣椒胞质雄性不育的分子机理提供理论依据。