云南涮辣CaERF2转录因子调控辣椒素生物合成的分子机制

Capsaicin is a kind of secondary metabolite with important bioactivities that is unique to Capsicum. Yunnan shuanla (Capsicum frutescens L. cv. Shuanlaense) is the hottest pepper variety in China. ERF is a sort of ethylene-responsive factors widely involved in plant secondary metabolism regulation. By transcriptome sequencing and q-PCR verification, we selected a transcription factor CaERF2 which was induced by ethylene and associated with capsaicin biosynthesis regulation in the Yunnan Shuanla (high capsaicin content) and Xiangtan Chibanjiao (low capsaicin content). In this research: (1) analysis of the specific binding ability between CaERF2 and ethylene -responsive elements, subcellular localization and interacting proteins to elucidate the basic characteristics of CaERF2; (2) to analyze the function and mechanism of CaERF2, investigation the relationship between the capsaicin content and the transcription profiling of CaERF2 and other key genes involved in capsaicin biosynthesis in Yunnan Shuanla’s placenta after induced by ethylene or interfered via VIGS; (3)comparison the gene sequence and promoter activity of CaERF2 among a large number of pepper resources to obtain the functional haplotype associated with high capsaicin content; investigation the activity of series truncated and deleted CaERF2 promoters to verify the key elements of ethylene-respond and the responsive mechanism to ethylene in Yunnan Shuanla. The research results will provide a theoretical basis for clarifying the mechanism of the capsaicin biosynthesis regulation.

辣椒素仅存于辣椒属植物、且具有多种生物活性。云南涮辣是我国已知最辣的辣椒资源。ERF(ethylene-responsive factors)是一类广泛参与植物次生代谢调控的转录因子。申请者前期对云南涮辣(高辣)和湘潭迟班椒（微辣）转录组测序，筛选到一个受乙烯诱导、与辣椒素生物合成候选相关转录因子CaERF2。本研究在此基础上，研究CaERF2与乙烯响应元件结合特性、亚细胞定位、互作蛋白等方面，阐明其基本特性；通过分别检测乙烯诱导和CaERF2基因沉默后云南涮辣CaERF2及辣椒素生物合成相关基因的表达谱变化和辣椒素含量的关系，解析其在调控辣椒素生物合成中的作用和机制；大样本检测CaERF2基因序列差异和启动子活性分析，筛选与高辣椒素密切相关的单倍型并进行功能验证，确定启动子中乙烯响应的关键元件和对乙烯的应答机制。为阐明辣椒素生物合成调控机理提供理论依据。

辣椒素仅存于辣椒属植物、且具有多种生物活性。云南涮辣是我国已知最辣的辣椒资源。ERF(ethylene-responsive factors)是一类广泛参与植物次生代谢调控的转录因子。申请者前期对云南涮辣(高辣)和湘潭迟班椒（微辣）转录组测序，筛选到一个受乙烯诱导、与辣椒素生物合成候选相关转录因子CaERF2。本研究在此基础上，（1）构建了含绿色荧光蛋白(GFP)的载体与 CaERF2 构建瞬时表达载体，转入洋葱表皮细胞，进行了CaERF2亚细胞定位研究，结果表明该基因定位在细胞核表面，而对照GFP 蛋白无核定位功能，可经过核孔复合物扩散进入细胞核，从而在细胞核内和细胞质中都可以观察到清晰的 GFP 的绿色荧光信号；利用凝胶阻滞分析技术，确定其能与乙烯响应元件(GCC-box)实现特异结合；利用酵母双杂交等技术研究了与其互作的蛋白，通过比对共获得6个与CaERF2相互作用的蛋白；（2）利用qRT-PCR 技术检测乙烯诱导下云南涮辣 CaERF2 及辣椒素生物合成相关基因(如 CS、 PAL、 KAS、 FAT、 pAMT 等 20 个左右)在不同时间点的转录水平，研究结果表明乙烯对辣椒素的生物合成有调控作用；完善了基于涮辣子叶和真叶的VIGS技术体系，并利用VIGS沉默CaERF2，并检测辣椒素生物合成相关基因的表达，结果表明CaERF2对辣椒素的生物合成具有调控作用，并发现其主要通过调控苯丙氨酸代谢途径的代谢来调控辣椒素的生物合成；（3）获得了105分不同辣度辣椒种质资源CaERF2编码区和调控区的碱基序列，找到了与不同辣度相关的单倍型，研究发现单倍型CCTT和单倍型 ATCC启动子在正常培养条件下即具有一定的活性，但单倍型CCTT启动子的启动活性高于单倍型 ATCC；研究发现CaERF2启动子中含有3个正向调控区域（-1162到-931, -780到-435，-435到-248 bp）并调节启动子的基本活性，-931到-780 bp的151 bp的启动子区域和-435到-248 bp的187 bp的启动子区域含有乙烯响应元件。以上研究结果丰富了辣椒素生物合成调控机理。项目执行期间，发表论文5篇，其中SCI收录1篇；培养人才23人.次；获得省部级奖励4次。