DNA磷硫修饰蛋白DndE与DNA复合物结构研究

DNA backbone phosphorothioation modification, in which sulfur replaces a nonbridging phosphate oxygen, found by prof. Zixin Deng and his members, and colaborators in 2007, was discovered that the dnd gene products incorporate sulfur into the DNA backbone in a sequence- and stereo-specific manner, and DNA phosphorothioation has also been found widespread and quantized in bacterial genomes.It was reported that the five-gene dnd cluster (dndA-E) caused DNA degradation during electrophoresis. However,the mechanism about how DNA backbone phosphorothioation is produced, and its biological function remain extremely unclear. Moreover, how DNA phosphorothioation is controled by five proteins (DndA,DndB,DndC,DndD and DndE encoded by dnd gene cluster) is also kept unknown. Previously, in a project funded by NSFC, we determined three dimensional structure of DndE by using X-ray technique, two dimensional NMR mothod and fluorescence anistrospy assay, revealing that DndE is neither a sulphur transferase, nor a NCAIR synthase analogue, but a nicked dsDNA binding protein with an unrecognized folding. In this project, to investigate the detailed structural basis for DndE functioning in the pathway of DNA phosphorothioation, we plan to determine the structure of the complex of DndE bound with dsDNA or nicked dsDNA by using X-ray and NMR techniques, combined with the predicted biological functions of DndA, DndB, DndC and DndD.

DNA骨架磷硫修饰是我国科学家邓子新院士团队于2007年在细菌中发现的第一种DNA骨架生理性修饰，具有立体选择性（Rp）和分布普遍性，针对不同菌株还具有DNA碱基序列专一性。DNA磷硫修饰受dndABCDE五个基因所编码的蛋白(DndA,DndB,DndC,DndD和DndE)控制，但5个蛋白具体如何发挥作用以完成DNA磷硫修饰没有任何文献报道。我们前期利用NMR和X-衍射等技术确定了DndE蛋白三维结构，表明DndE是一个具有新型骨架的nicked dsDNA结合蛋白，而不是基于生物信息学分析所得的硫转移蛋白，或者NCAIR合成酶类似蛋白。本项目计划利用X-ray、NMR技术、荧光极化技术等技术，开展DndE与dsDNA复合物三维结构研究，同时结合DndA、DndB、DndC和DndD蛋白预测的功能，以及体内体外实验，探讨DndE蛋白在DNA磷硫修饰过程中发挥生理功能时的结构生物学基础。

DNA骨架磷硫修饰是在细菌中发现的第一种DNA骨架生理性修饰，具有立体选择性（Rp）和分布普遍性，针对不同菌株还具有DNA碱基序列专一性。DNA磷硫修饰受dndABCDE五个基因所编码的蛋白(DndA,DndB,DndC,DndD和DndE)控制。我们前期利用NMR和X-衍射等技术确定了DndE蛋白三维结构，表明DndE是一个具有新型骨架的nicked dsDNA结合蛋白，而不是基于生物信息学分析所得的硫转移蛋白，或者NCAIR合成酶类似蛋白。结合nicked dsDNA的位点处于正电荷富集区即DndE四聚体中心部分，该部分由氨基酸K18, K19,G21及G24组成。本项目原计划利用X-衍射开展DndE与dsDNA复合物三维结构研究，但遗憾的是由于DndE与dsDNA的结合作用太弱，我们最终没有得到DndE与dsDNA复合物晶体。为此，我们尝试将处于四聚体中心的G21和G24突变为K，同时将可能处于dsDNA结合的四聚体凹槽处的氨基酸L58突变为K58，然后利用荧光极化方法测定这些突变体与nicked dsDNA的结合能力，发现它们比野生型DndE结合能力增强1-100倍以上。但是我们没有得到突变体与dsDNA复合物晶体，最终只得到分辨率为2.9Å的突变体DndEG21/24K晶体，分析表明该突变体是一个四聚体，但单体的排列方式不同于野生型DndE，而且我们前面预测的结合dsDNA的位点不再处于四聚体的表面。这表明DndE结合nicker dsDNA不是以四聚体形式与dsDNA结合。利用Dali服务器我们发现P22 Arc抑制因子与DndE结构具有很高的相似性。以P22 Arc抑制因子与dsDNA复合物结构 (PDB code: 1BDT )为模板，我们构建了DndE与dsDNA复合物的模型，该模型表明前面所提及的DndE上氨基酸、N端Loop上4-NRMAL-8以及连接N端和C端的长Loop上的57-TLVLD-61片段,可能对结合dsDNA非常重要，该假设进一步得到定点突变实验、与DNA结合实验结果的证明。同时，DndE突变体与nicked dsDNA的结合增强，Dnd phenotype也增强. 自此，DndE与nicked dsDNA结合模式得以明朗。通过本项目的实施，发表标注基金项目编号SCI论文6篇（含1篇综述），另外1篇论文在投。