茶树中茶氨酸水解酶分离纯化及其基因克隆研究

Theanine hydrolase is a key enzyme in the catabolism of theanine in Camellia sinensis. However, purification and cloning of theanine hydrolase has not been made a breakthrough progress, which significantly restrict the development of research on the molecular regulation of theanine metabolism in Camellis sinensis. In this project, high activity of theanine hydrolase of tea leaves are used as material, and theanine hydrolase is purified by several chromatography techniques and protector of enzyme on the protein purification system and fast protein liquid chromatography. The amino sequence of N-terminal and small peptide of theanine hydrolase is sequenced by Edman degradation and MALDI TOF MS/MS. According to the amino sequence of N-terminal and small peptide of theanine hydrolase, the full length cDNA of theanine hydrolase is obtained by RT-PCR and SMART RACE. This project provided a theoretical basis for the researchs on the molecular regulation of theanine mechanism and the germplasm improvement in Camellis sinensis.

茶氨酸水解酶是茶树体内茶氨酸分解代谢的关键酶。但茶氨酸水解酶的分离纯化和基因克隆研究一直未取得突破性进展，严重制约了茶树体内茶氨酸代谢调控分子机制的深入研究。本项目拟以茶氨酸水解酶活性相对较高的茶鲜叶为材料，采用蛋白质层析系统和快速蛋白质纯化液相系统，通过多种蛋白质层析技术手段和酶活性保护剂的应用，分离纯化茶氨酸水解酶，并利用Edman降解法和MALDI-TOF MS/MS串联质谱对纯化的茶氨酸水解酶N-末端和内肽氨基酸序列进行分析；根据获得的部分氨基酸序列，通过RT-PCR和SMART RACE技术得到茶氨酸水解酶基因全长cDNA序列，为揭示茶树体内茶氨酸代谢调控分子机制及茶树种质资源改良奠定理论基础。

本项目计划通过多种蛋白质层析技术手段，分离纯化茶氨酸水解酶，获得其部分氨基酸序列进而克隆茶氨酸水解酶基因全长cDNA序列。.三年来，我们按照研究计划对本项目开展研究，主要取得如下研究结果：.通过HPTLC法结合紫外分光光度法，建立了高通量、低成本的茶氨酸水解酶活性快速检测方法，可用于茶氨酸水解酶活力的初步筛选。建立了一种无需衍生的检测21种氨基酸的ELSD-HPLC检测方法，可用于茶氨酸水解酶活力的精确定量。.筛选比较了19种茶叶品种鲜叶材料的茶氨酸水解酶活力。结果表明，不同品种间茶氨酸水解酶活性存在显著差异，选择活力较高的桃源大叶种和政和大白茶作为茶氨酸水解酶纯化的原材料。.研究了几种常用的酶活力保护剂对茶氨酸水解酶的保护作用。结果表明，10%的蔗糖、15%的海藻糖、20%的甘油保护效果最佳。考虑保护剂对缓冲液粘度的影响及酶活力保护效果，选择添加20%的甘油作为酶活性保护剂。.通过硫酸铵沉淀、离子层析和凝胶层析分离纯化了茶氨酸水解酶。结果表明，经过硫酸铵沉淀后茶氨酸水解酶活力主要存在于55-70%和70-95%的硫酸铵沉淀；经脱盐后，过Q Sepharose FF阴离子柱层析，洗脱后获得5个主要蛋白峰，茶氨酸水解酶活力主要存在于第2个蛋白峰。将离子层析蛋白峰上Superdex 200凝胶层析，洗脱后获得4个主要蛋白峰，茶氨酸水解酶活力主要存在于第4个蛋白峰。与粗酶液相比，茶氨酸水解酶比活力提高了约86倍。茶氨酸水解酶由30 KDa左右和40 KDa左右两个亚基组成。.对茶氨酸水解酶的酶学性质进行了研究。结果表明，茶氨酸水解酶最适温度35℃，最适pH值8.5，最佳底物浓度75 mM-125 mM；可水解L-茶氨酸、L-谷氨酰胺和谷胱甘肽，但不能水解L-天门冬酰胺。推测茶氨酸水解酶与谷氨酰胺酶可能为同一种酶。.采用Edman降解法或串联质谱（MALDI-TOF MS/MS）鉴定茶氨酸水解酶。结果显示，茶氨酸水解酶N末端封闭以及质谱鉴定的失败未能获得部分茶氨酸水解酶氨基酸序列，无法进行下一步通过部分氨基酸序列进行cDNA克隆。拟通过新增部分实验内容，再进行质谱鉴定获得部分茶氨酸水解酶氨基酸序列，进而获得茶氨酸水解酶cDNA序列。