新型HIV-1膜融合抑制剂P20作用靶点的确定及抑制机理的研究

HIV-1 gp41 is a transmembrane protein mediated the fusion between virus and the host cell membranes. T-20 was licensed by the U.S. FDA as the first HIV fusion inhibitor in clinical use. It can easily develop virus resistance, so a new type of fusion inhibitor which is different from T-20 is needed. In the previous work, We conducted yeast two-hybrid screening on a human bone marrow cDNA library. Using the recombinant soluble gp41 ectodomain as bait, we identified a novel gp41 core-binding molecule, designated P20, which showed no homology with current HIV fusion inhibitor, T-20. P20 was effective in inhibiting infection by a broad spectrum of HIV-1 strains including T-20 resistant strains. Besides, there are different functional characteristics between T-20 and P20. Hence, we presume that the binding sites and the inhibition mechanism between them are different. In this project we will focus on the structure and function study. We construct a series of mutant gp41 fusion core-6 helix bundle together with mutant pesudovirus system to map the critical binding sites of P20 and the 6-helix bundle.We also use X-ray crystallography methods to analyze refined 3D structure of the compound of P20 and the 6-helix bundle. We try to elucidate the inhibitory mechanism of P20 from results above comprehensively.This study provides insights into the mechanisms of HIV-1 entry into target cells with implications for the design of novel HIV-1 fusion inhibitors.

HIV-1 gp41在病毒进入细胞的膜融合过程中起着关键作用。膜融合抑制剂T-20是被美国FDA批准的治疗艾滋病的多肽药物，由于T-20容易引发耐药现象，因此需要研究一种新型的膜融合抑制剂。在前期工作中，我们利用酵母双杂交技术，以rsgp41为诱饵蛋白，筛选到一个具有广谱抗病毒活性的多肽片段-P20。P20虽然与T-20没有任何序列同源性，但能够抑制T20抗性毒株感染靶细胞。此外，P20在某些重要功能特性上与T-20不同。据此，可以推测，它们作用的靶点（结合位点）以及抑制病毒感染的作用机理可能不同。本研究将构建 gp41 N/C六螺旋的突变体，结合假病毒技术确定P20与六螺旋相互作用的靶点，并通过晶体学技术，解析六螺旋与P20复合物的精细三维结构，综合分析其结构与功能的关系，从而揭示P20的抑制机理。对P20的深入研究将有利于深入了解HIV-1病毒的感染过程，也为新型抑制剂的开发奠定基础。

 HIV病毒多肽抑制剂（P20)的作用机制研究。在前期实验中，我室研究证明P20是候选HIV病毒多肽抑制剂（P20)。该项成果发表在J. Virology杂志上。通过构建gp41 N/C 六螺旋的突变体进行研究，发现了P20与NC六螺旋结合的三个关键性位点及作用机理。. 我们对一些潜在的膜融合抑制剂进行改造，提高其抑制活性。在三聚体N28Fd的N端加入CCGG四个氨基酸（ccN28Fd）。与上市药物T20相比，ccN28Fd的抑制效果提高6-10倍，能够抑制多种临床毒株，并且能很好的抑制T20抗性毒株。我们尝试将ccNA28Fd开发成杀微生物剂作用于酸性的阴道环境中，进一步开发为临床用药。. HIV包膜蛋白gp41与蛋白POB1相互作用及科学意义。gp41可以竞争性的抑制RalBP1与POB1的相互作用。流式细胞仪检测结果表明转染了gp41质粒的A431细胞内吞EGF的量大大增加，并且有利于HIV假病毒的摄入。我们推测gp41可以通过与POB1的相互作用调控人体内的内吞通路，从而增强HIV病毒的内吞摄入。. 利用生物信息学手段研究HIV-1毒株对于中和抗体的抗性。我们利用抗体抑制假病毒侵染试验的数据，筛选出对抗体抑制具有抵抗能力的毒株及基本序列。通过与抗体抑制毒株的基本序列对比，我们发现在gp41氨基酸序列上确实存在具有统计显著性的关键位点。为了验证生物信息学结果，我们对HXB2毒株在对应位点进行突变并利用假病毒抑制试验检测突变后毒株对于中和抗体的抗性变化。. HIV病毒多选择CCR5作为辅助受体。众多结果表明CCR5是HIV疫苗设计的重要靶点。我们发现CCR5上存在一个之前没有引起人们关注的区域，我们将其命名为近膜区（MPR）。我们发现MPR特异性的抗体能够显著抑制CCR5嗜性假病毒的感染，而不抑制CXCR4嗜性毒株的感染。不同于针对ECL1的抗体，MPR特异性抗体不会引起CCR5的内吞。其次，如果用其它几种趋化因子受体上同样的区域替换MPR，病毒的进入会明显受到影响。这些实验证明了MPR在病毒进入过程中的重要作用，是一个疫苗设计的新靶点