家蚕伴性赤蚁突变基因的定位克隆及其温敏致死研究

刚孵化的家蚕幼虫体色呈黑色，突变品种家蚕伴性赤蚁(sex-linked chocolate,简称sch）孵化时，体色呈咖啡色，由于具有温敏致死的特点对蚕业具有重要应用价值。但到目前为止，通过各种研究方法都没能成功克隆该基因，使产业应用受到限制。本研究拟通过定位克隆技术，结合家蚕基因组物理图谱和遗传多态性图谱，对突变材料与正常品种大造的回交群体及亲本进行SNP分子标记的连锁分析，锁定突变区域；分离克隆该基因并对其进行功能研究；确定该基因在黑色素合成中途径中的位置及功能；阐明它与sch温敏致死的关系，为以后在产业上更好的利用该品种提供理论指导；同时，通过该基因的定位克隆，建立完善家蚕的定位克隆技术体系，为克隆其它与家蚕重要经济性状相关的突变基因奠定基础；通过该基因的功能研究，也为昆虫体色形成及黑色素合成研究提供理论参考。

伴性赤蚁（sch）突变纯合型具有巧克力色的体色，与野生型棕黑色蚁蚕体色不同。经典遗传学研究表明，该突变位点位于家蚕的性染色体Z上，与性别连锁，而且在胚胎发育后期具有温敏致死效应。这两个特征使其成为调控性别的重要靶标基因。sch 突变是自上世纪80年代发现以来，为了获得其突变基因，相关研究论文达20多篇。尽管研究者们为克隆该基因做出了不懈的努力，但是都为获得其突变基因和阐明突变机理。本项目基于家蚕基因组信息和遗传连锁图谱，对该基因分离群体进行连锁分析。经过SNP标记筛选和4501个回交个体的连锁分析，最后锁定了sch突变基因所在区域，最终确定了该突变为家蚕编码酪氨酸羟化酶(TH)基因调控区域突变所致。在sch突变及等位致死突变中，两个不同类型的转座子破坏该基因的转录调控序列，导致BmTh基因的表达量急剧减少。通过RNAi及添食TH抑制剂降低野生型BmTh基因的表达产物，获得sch突变表型个体；添食酪氨酸羟化酶下游产物dopa成功营救sch突变表型。这些结果清楚地表明酪氨酸羟化酶的表达量减少是 sch突变幼虫形成巧克力色表皮和高温处理不能孵化的直接原因。根据上述研究结果，我们提出了sch温敏致死机理假说。家蚕酪氨酸羟化酶基因启动子的缺失，在高温下，sch不能有效应答热激蛋白类调控因子对该基因的增量表达，表达比常温更少的酪氨酸羟化酶基因蛋白，产生更少的黑色素产物dopa，导致其孵化相关器官的黑化和硬化不够，最终因孵化不能而死亡。该研究结果发表在2010年7月《美国科学院院刊》上。同时，项目组还开展了家蚕酪氨酸羟化酶基因的功能研究，包括原核表达、蛋白纯化、酶活测定并制备了相关抗体，进行了组织定位。利用转录组学技术和芯片技术，对sch和DZ蚁蚕进行了全基因组学差异表达基因的分析。这些结果进一步为验证家蚕温敏致死机理提供了分子水平证据。通过该基因的定位克隆，建立了大规模的家蚕定位克隆平台体系，为后期突变基因定位克隆奠定基础。