家蚕缩蚕突变基因的定位克隆及功能研究

Silkworm contactile mutant (cot) is one kind of behavior mutatant. The body length of the homozygous( cot/cot )larvae is slightly shorter than that of the wild type. After being touched, its body shrinks to two-thirds or half, accompanied by vomiting digestive juices, flipping body and staying still for a period of time. Because of its phenotype similar to human epilepsy disease,the research of cot mutant has attracted much attention.In our previous research, it was found that temperature can induce the cot phototype when keep cot in 30℃ for 5min. Although Japanese scholars have map cot loci on the 25.0 site of the 15th linkage groups of the silkworm, the mutation gene has not been cloned and the mutation mechanism remians unclear. Therefore, this project proposes to perform linkage map of cot with SNP molecular marker among the backcross populations, combination with silkworm genome physical map and genetic polymorphism map; separate and clone cot mutant gene; identify the function of candidate gene by silence gene method or transgenosis. On this basis, study on the relationship between epilepsy phenotype and temperature.Also the project will clarify molecular mechanism of cot mutant gene causing epilepsy phenotype and provide a theoretical reference for medical application of cot mutation gene in silkworm. Through the implementation of the project, explore the possibility of technology platform and system in which silkworm is as a model organism for the study of human disease.

家蚕缩蚕（cot）突变是一种行为突变。cot纯合幼虫的体长比野生型略短，用手触摸后，身体缩为三分之二或一半，伴随吐消化液和身体翻转，并在一段时间内保持不动。因其表型与人类癫痫疾病类似，cot突变体研究备受关注。项目在前期的研究过程中，发现cot突变表型是受温度诱导的，当cot在30℃下处理5分钟以上，即诱发癫痫表型。尽管日本学者已将cot定位于家蚕第15连锁群的25.0，但到目前为止，仍未精确定位该突变基因，其突变机制也不清楚。因此，本项目拟通过定位克隆方法，结合家蚕基因组物理图谱和遗传多态性图谱，对突变品种与正常品种的回交群体及亲本进行SNP分子标记的连锁分析，锁定突变区域；分离克隆cot突变基因；利用基因沉默或者转基因对侯选基因进行功能验证，在此基础上，研究癫痫表型与温度的关系，阐明cot突变基因引起癫痫表型的分子机理，为医学上对家蚕cot突变基因的应用提供理论参考。

家蚕缩蚕（cot）突变是一种行为突变体，其表型为cot幼虫的体长比野生型略短，用手触摸后，身体缩为三分之二或一半，伴随吐消化液和身体翻转，并在一段时间内保持不动。缩蚕突变由单基因控制，呈隐性遗传，被定位于第15连锁群的25.0位点。因其表型与人类癫痫疾病类似，cot突变是极其珍贵的行为遗传研究材料。由于cot突变表型的鉴定最初是用人手摩擦蚕体诱导突变表型的产生，但该鉴别方法因个人用力差异及体温差异导致突变表型的诱导不稳定。项目组首先通过温度和物理刺激两方面的因素探索其诱发原因，结果表明，cot的突变性状主要由温度诱导产生。为了分离鉴定其突变基因，本项目利用定位克隆方法对其进行分离克隆。研究结果表明，一个编码钾离子通道蛋白（Bmsei）基因发生突变。蛋白的组织定位表明该蛋白主要在神经组织细胞中表达，而且，蛋白随着温度的上升会发生降解。为了验证其功能，本项目利用胚胎RNAi技术对其进行了功能研究，结果表明，干涉后的蚕在高温诱导下也诱导出与cot类似的突变表型；同时，项目组利用目前癫痫疾病的诱导试剂及抑制剂分别注射正常家蚕及cot，结果显示，正常家蚕注射癫痫疾病的诱导试剂后表型出cot表型，而cot在注射挽救试剂后，其症状明显减轻。这些研究结果表明，Bmsei基因是cot的突变基因；同时表明，家蚕具有作为癫痫疾病昆虫模型的潜能。为了揭示Bmsei基因突变后引起cot突变体中其它分子途径的变化，本研究还利用转录组学及蛋白质组学对其进行了分析，结果表明热激蛋白-1和Tn1在cot中受高温影响后显著上调，在响应高温应激方面发挥重要的作用。参与泛素体系、烟碱乙酰胆碱受体的差异表达基因、心脏兴奋-收缩偶联过程、Notch信号通路也参与了这一过程。通过本项目的执行，为昆虫高温热保护应急反应提供了分子参考，同时，也为家蚕作为癫痫疾病研究提供信息。