抗肿瘤抗生素海沟霉素A和B的生物合成及其功能基因研究

九元环吲哚内酰胺类抗生素因其能够激活对多种细胞进程具有重要作用的蛋白激酶C，诱导干细胞的定向分化和提高癌细胞对抗癌药物（顺铂）的敏感性而备受关注，但该类化合物的体内生物合成机制和生物合成过程中的关键基因的功能还没有得到阐明。我们从一株南海深海放线菌中筛选分离得到两个九元环吲哚内酰胺类抗生素，命名为海沟霉素 A和B，显示较强的体外抗肿瘤活性。本项目以该深海放线菌为研究对象，期望获得海沟霉素A和B完整的生物合成基因簇，通过对其生物合成基因簇的结构基因和后修饰基因进行敲除，构建双交换基因突变株，分析突变株产生的生物合成中间体或结构类似物，阐明其生物合成机制；并对重要的后修饰基因进行体外表达、纯化和酶促反应动力学表征，深入了解吲哚内酰胺类抗生素的生物合成机制及其独特的酶学机理。

九元环吲哚内酰胺类抗生素是自然界中为数不多的具有广泛的生物活性的一类化合物。Methlpendolmycin（海沟霉素A）和pendolmycin（海沟霉素B）属于结构新颖、生物活性显著的九元环吲哚内酰胺类抗生素，是我们课题组于2011年从南海北部海沟深3865m的海洋沉积土来源的深海放线菌新属新种Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 中分离得到。前期的研究结果显示该类九元环吲哚内酰胺类化合物能够与蛋白激酶C结合从而影响下游的信号转导过程。且最新的研究结果显示，该类化合物的母核结构吲哚内酰胺V能够诱导干细胞定向分化成胰腺细胞。上述研究表明该类化合物具有重要的应用前景。但是深海放线菌来源的此类化合物的生物合成研究未见报道。.在此背景下，本项目以具有我国自主知识产权的南海新属放线菌M. Thermotolerans 00652为研究载体，以其产生的结构新颖、生物活性显著的吲哚内线胺类化合物海沟霉素A和B为研究对象，以该菌株遗传操作体系的建立和生物合成基因簇的获得及其生物合成机制的阐明为拟解决的关键科学问题。通过利用分子生物学、生物信息学、微生物学和天然产物化学等多种手段，成功地建立了该菌株的遗传操作体系，获得了其完整的生物合成基因簇，其基因簇全长为14.3kb，有7个基因组成，mpnABCDEFG，分别编码N-乙酰葡萄糖胺磷脂酰肌醇脱乙酰基酶、非核糖体肽合成酶、细胞色素P450氧化酶、异戊烯基转移酶、还原酶/氧化酶、异戊烯基二磷酸异构酶及GNAT家族的乙酰基转移酶；其中mpnBCD三个基因足以完成海沟霉素A和B的生物合成，阐明了该化合物的体内生物合成过程；通过体内基因缺失，获得了3个新生物合成中间体，发现了一个对含色氨酸的天然产物的C-7进行反式异戊烯基化的异戊烯基转移酶及一个催化芳环C-N键闭合的细胞色素P450氧化酶。此外也成功实现了该菌株在模式菌株的稳定高效的异源表达，通过对该生物合成基因簇的上游基因的进一步分析，在距结构基因mpnB上游基因9.752kb处存在一个双组份调控系统。为定向合成或构建新的吲哚内酰胺类抗生素及相关酶的机理研究奠定基础和提供理论支持。发表论文3篇，其中SCI论文2篇，中文核心期刊1篇，培养硕士研究生1名。圆满完成了该项目的预期目标。.