达托霉素生物合成调控基因的鉴定和功能研究

耐药病原菌所致感染严重威胁我国人群健康。达托霉素是治疗革兰氏阳性耐药菌感染的重要药物。达托霉素是玫瑰孢链霉菌产生的一种环脂肽类抗生素，其生物合成基因簇已被克隆，生物合成途径已基本阐明，然而合成调控机制尚不明了。达托霉素基因簇中未发现合成调控基因，这与抗生素生物合成结构基因通常和调控基因连锁在一起不同，表明其合成调控有独特的机制。本项目将从靶向基因破坏基因簇下游调控基因和利用报道基因指引的转座随机突变文库筛选两方面来鉴定达托霉素生物合成调控基因。其次，通过基因破坏、遗传互补和高表达研究等分子遗传学手段来阐明调控基因的功能。另外，通过生物合成基因簇转录谱分析和凝胶阻滞等分子生物学手段初步揭示其调控的分子机制。本研究将为阐明达托霉素独特的生物合成调控机制提供重要依据，而且对理性提高其产量有重要的理论指导意义。

达托霉素是治疗革兰氏阳性耐药菌感染的重要药物。本项目旨在揭示达托霉素生物合成调控的独特机制，丰富非核糖体肽生物合成调控的机理，也为理性提高达托霉素产量提供理论指导。本项目取得了如下重要的成果：.1. 核糖体蛋白调控达托霉素生物合成的分子机理。链霉菌中，核糖体蛋白基因调控抗生素的生物合成，然而分子机理尚不明确。本研究采用“核糖体工程”方法，并结合基于报告基因的筛选方法获得了两个调控达托霉素生物合成的新的核糖体突变，分别是编码核糖体蛋白S12的 rpsL （L43N）和编码核糖体蛋白S3的rpsC（G152V），突变株中达托霉素产量分别提高2.2倍和1.8倍。通过定量蛋白质组（iTRAQ）比较野生型菌株和两株高产株的蛋白表达差异，发现了有57个和24个蛋白在两个高产突变株中表达量分别都发生了上调和下调。上调的蛋白包含大量核糖体蛋白，表明核糖体蛋白合成能力的增加可能是达托霉素高产的机制之一，下调的蛋白包含精氨酸和组氨酸代谢等氨基酸代谢基因，暗示氨基酸前体供应是调控达托霉素生物合成的重要途径。过表达上调基因，如甘油激酶，核糖体循环因子和小中性蛋白调控蛋白都导致达托霉素产量的提高，该研究不仅发现了新型达托霉素生物合成调控基因，也表明定量蛋白质技术能够用于发现抗生素生物合成调控蛋白。.2. 达托霉素生物合成前体相关基因调控达托霉素生物合成。癸酸和犬尿氨酸是合成达托霉素的两个重要前体，本研究解析了犬尿氨酸的合成途径和癸酸耐受的分子机理。通过控制犬尿氨酸合成途径，过表达色氨酸2，3加氧酶tdo和dptJ后，产量分别增加了7%和112%。将犬尿氨酸酶kyn敲除后，产量增加了33.75%；玫瑰孢链霉菌癸酸耐受与细胞膜脂肪酸组成密切相关。支链脂肪酸是玫瑰孢链霉菌的主要脂肪酸，BCDH是其合成关键酶。链霉菌基因组有两个编码BCDH的基因簇，分别为bkd1和bkd2. Bkd1是支链脂肪酸合成的关键酶，其敲除株细胞膜中支链脂肪酸含量显著降低，直链脂肪酸含量增加，突变株对癸酸更加敏感，并且丧失了达托霉素的合成能力，互补菌株恢复了支链脂肪酸含量和癸酸耐受能力。. 本项目发现了数个调控达托霉素生物合成的调控基因，初步揭示了达托霉素独特和复杂的调控机制，此外，本研究采用的方法和思路也可供其他研究抗生素生物合成调控的研究者使用。