抗菌环肽类抗生素ilamycins的生物合成研究

Cyclic peptides exhibited an interesting spectrum of biological activities, including anticancer, antibacterial, antiviral, immunosuppression and antimalarial, et al, making them bright stars in drug discovery and development. Six cyclic peptide compounds showed antibacterial activity have been discovered from an actinomycete strain,Streptomyces sp. SCSIO 16, which was isolated from the South China deep sea. The structures of these six compounds were elucidated by NMR, LC/MS/MS and single crystal diffraction methods. We found that they were ilamycins, and four of them were new compounds. So far, the biosynthetic pathway of ilamycins has not been elucidated since they were discoveried in 1964. This study will focus on the biosynthetic investigations of the ilamycins in Streptomyces sp.SCSIO 16. We will : 1) clone and sequence the biosynthetic gene cluster of ilamycins through genome scanning method;2)analyze the unique structures of the gene cluster of ilamycins using bioinformatic method; 3)make mutants to eluciate the function of key genes in the ilamycin biosynthetic gene cluster and generate new analogues; and 4) characterize key enzymes catalyzing novel chemistry via in vitro biochemical method in the biosynthetic pathway.

环肽类抗生素因其具有抗癌、抗菌、抗病毒、免疫抑制及抗疟等重要的生物学活性，已成为了现代药物研发的重点关注对象。我们从南海海洋放线菌Streptomyces sp. SCSIO 16中分离得到了一类具有良好抗菌活性的环肽类抗生素（共6个），经NMR、LC/MS/MS及其单晶衍射，发现其为ilamycins环肽化合物，其中4个为与其类似的新化合物。这类化合物自1964年首次被发现以来，其生物合成机制的研究尚未报道。本项目以ilamycins的产生菌为研究对像，期望获得ilamycins化合物的生物合成基因簇，拟对其生物合成基因簇的结构基因、调控基因、后修饰基因进行体内敲除、回补和代谢产物分析。对重要功能基因进行异源表达、蛋白纯化和酶反应动力学表征，阐明其生物合成机制和负责其独特结构单元合成的酶系。

肺结核依然是世界上最严重的传染性疾病，然而，目前由于耐药结核菌的快速出现和与HIV疾病的并发，使得有限的现有结核药物对对该病的治疗的效力却在快速的下降。因此，对新型抗结核药物的研发迫在眉睫。在我们以药物开发为目的的海洋放线菌来源的活性天然产物的筛选中，我们从深海链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16中发现了6个具有抗结核活性的含有稀有 L-3-硝基-酪氨酸和 L-2-氨基酸-4己烯酸(L-AHA)结构单元的ilamycins的同系物（(ilamycins B1, B2, C1, C2, D, and E1; 1–6）。我们通过单晶衍射解决了这类化合物中原来没有被解决的两个结构单元的立体化学问题，包括 ilamycins B2, C1, C2, D 和F (2–5，8) 中的环氧环的立体化学问题和ilamycin D 中的2-氨基-4-甲级戊二酸结构单元中的γ-C的立体化学问题。此外，我们通过基因组测序、生物信息学分析和基因敲除等方法首次鉴定了负责ilamycin生物合成的基因簇，其基因簇由一个含有7个模块的巨型NRPS负责ilamycin化合物骨架的形成。L-3-硝基-酪氨酸和 L-2-氨基酸-4己烯酸(L-AHA)结构单元的形成机制首次通过基因敲除、化合物的前体回补、及同位素喂养等方法进行了阐明。两个后修饰氧化酶P450的功能通过基因敲除和代谢中间体的分离及结构解析得到了鉴定。ilamycins 化合物显示出特异性的抗结核分枝杆菌活性，而且含有六元环结构单元的化合物还同时具有对多种肿瘤细胞系具有良好的肿瘤细胞毒活性。值得一提的是，对结核分枝杆菌H37Rv菌株具有显著抗结核活性的两个新化合物ilamycinE1和E2可以在一个基因工程突变株中可以以较高的产量得到生产（13.5 mg/L）且其对M.tuberlucosis H37Rv的抑制活性的MIC为9.8 nM，其活性是一线抗结核药物利福平的30倍。我们的研究为抗结核药物的研发提供了极为有效的先导化合物。