小G蛋白（Rab、Ran）在对虾抗病毒细胞吞噬中的作用

病毒性疾病近年来对我国对虾养殖业造成了很大打击，至今仍无有效的防治手段，对对虾抗病毒免疫机理的研究是寻求防治手段的根本方法。吞噬作用作为对虾细胞免疫的重要方式，目前对其抗病毒的研究仍十分有限。本实验室在之前的研究中发现小G蛋白（Rab、Ran）可以在对虾细胞内形成蛋白复合体同时能调节血细胞抗病毒吞噬作用，本项目通过分子生物学和免疫学技术研究小G蛋白（Rab、Ran）复合体内部的结合位点，检测小G蛋白复合体对对虾血细胞吞噬活性和病毒感染的影响，分析小G蛋白复合体对调节细胞吞噬的效应蛋白构象的影响，并进一步探讨小G蛋白复合体在对虾体内的构象变化及其与吞噬小体和溶酶体形成的关系。本项目对于研究对虾对病毒病的细胞免疫机制和探寻免疫对虾抗病毒病的途径具有十分重要的科学意义。

进行siRNA在对虾抗病毒中的应用研究。一方面，成功地用葡聚糖包被vp28-siRNA，并在注射入对虾体内24小时后检测到vp28-siRNA。攻毒试验表明，葡聚糖包被vp28-siRNA组的死亡率相对较低，只有60%。而WSSV攻毒组的死亡率高达95%。同时vp28-siRNA组的病毒拷贝数有显著下降，而WSSV攻毒组则显著上升。研究证明葡聚糖包被vp28-siRNA能有效地降低siRNA在对虾体内的快速降解，有良好的抑制WSSV复制、提高对虾成活率的作用，是一种很有应用前景的方法。另一方面，利用工程菌E.coli HT115成功地表达vp28-siRNA，注射对虾后24h和48h，在日本对虾血细胞内检测到siRNA。攻毒试验显示vp28-siRNA注射24h后病毒拷贝数有显著下降，而WSSV攻毒组则显著上升。VP28-siRNA注射24h后的死亡率显著低于攻毒组。结果证明工程菌表达VP28-siRNA是一种很有价值的生成siRNA的方法，同时也是一种递送siRNA的良好途径。. 研究发现，白斑综合征病毒(WSSV) 和果蝇C病毒（DCV）可以被果蝇S2细胞内吞，但只有果蝇C病毒可以被S2细胞完全吞噬。当脂多糖或肽聚糖激活S2细胞，白斑综合症病毒颗粒可被完全吞噬。基因表达谱结果显示，dally介导的Wnt信号通路参与了S2细胞对两种病毒的早期反应。进一步的研究证实，Wnt信号通路的多个重要小G 蛋白基因及与dally互作的Amph（介导内吞和胞吐作用）、 GLT（涉及GTP酶在组织中的肌动蛋白细胞骨架）和 INSC（骨架适配器）都参与了细胞对两种病毒的吞噬。因此，我们的研究着重于发掘新的吞噬病毒的信号通路和分子机制。由于Wnt信号通路的重要基因在无脊椎动物缺少相关序列信息，因此较难进行基因克隆，所以工作的重心主要集中在研究Wnt信号通路调控的Amph等小G 蛋白基因以及基因表达谱显示表达量升高的基因。