重型乙型肝炎中NK细胞的趋化机制及其靶向干预研究

在乙型肝炎病毒所致的重型肝炎肝损伤中，免疫损伤机制占有重要的地位，尽管其生物学过程复杂，但免疫细胞趋化募集至肝脏为其首要条件。我们的前期研究首次在HBV感染所致的重型肝炎患者以及MHV-3诱导的暴发型肝炎小鼠模型中阐述了NK细胞在肝细胞损伤中重要地位：随着病毒感染后肝脏损伤的进展，骨髓、脾脏及外周血中的NK细胞有向肝脏募集的趋势，这些募集至肝脏中的NK细胞通过Fas-FasL和NKG2D-NKG2DL途径损伤肝细胞，耗竭动物模型体内的NK细胞可以明显改善其生存率。据此我们提出NK细胞趋化至肝脏是病毒性重型肝炎肝损伤的关键因素，通过对NK细胞趋化的靶向干扰可以缓解肝脏损伤。在新近的动物模型研究中，我们通过基因芯片初步筛选出CCR1和CCR5可能是NK细胞募集至肝脏的功能性趋化因子受体，通过进一步研究有望揭示该疾病中NK细胞的趋化机制，并为疾病靶向干预提供实验依据和治疗策略。

自然杀伤（NK）细胞在乙肝病毒感染导致的肝衰竭的发病机制中发挥了重要的作用。在前期研究中我们发现，在MHV-3介导的小鼠暴发性肝炎模型中，肝脏NK细胞的比例和数量显著增加，在感染48h达到峰值，相反在脾脏和骨髓，NK细胞比例和数量在感染后均显著减少。表明MHV-3感染后，NK细胞从脾脏，骨髓和外周血迁移募集至肝脏。但NK细胞趋化募集的具体机制仍不明确。.首先，我们利用基因芯片技术，筛选出具有差异表达的肝脏NK细胞趋化因子受体CCR5、CCR1、CXCR3以及CXCR4。其后的Real-time PCR实验表明，CCR5较其余三种受体表达水平发生了更为显著及平稳的变化。随后，流式细胞术检测发现，MHV-3感染后，CCR5+NK细胞在肝脏中的百分率显著增加，与正常对照组相比，在感染后24小时达到高峰。与之相反，CCR5+NK细胞的脾脏、骨髓及外周血的数量均在感染后12或24小时达到峰值，随后下降。ELISA法用于检测MIP-1α，MIP-1β和RANTES在肝脏中的表达，在感染后均逐渐上升，并于感染后72小时达到峰值。免疫组化染色亦证明感染后72小时MIP-1α，MIP-1β和RANTES在肝脏中的表达量最高。感染后的肝细胞MIP-1α，MIP-1β，RANTES mRNA的表达呈上升趋势，至72小时分别上升269倍，2015倍和189倍。Transwell细胞趋化实验证明，MHV-3感染的肝细胞能趋化脾脏NK细胞，不仅这种趋化效应能被抗CCR5的单克隆抗体阻断，而且可以被抗MIP-1α，抗MIP-1β，和抗-RANTES单克隆抗体分别阻断。MHV-3感染的肝细胞能趋化脾脏NK细胞，同时CCR5和其相应的趋化因子（MIP-1β，RANTES）在此趋化过程中发挥了重要作用。过继转移实验证实将脾脏CCR5阻断的NK细胞经尾静脉回输至MHV-3感染已将NK细胞耗竭的Balb/cJ小鼠后，可将生存时间延长至84-90h。HE染色证实过继实验24小时后，CCR5+NK过继组大量炎性细胞浸润和肝细胞死亡，血清ALT/AST水平均高于CCR5-NK过继组，肝脏NK细胞绝对计数亦显著增高。.本研究表明，CCR5及其配体MIP-1β和RANTES在 MHV-3诱导的肝损伤中对NK细胞向肝脏的趋化募集发挥了重要的作用，可能成为病毒性肝衰竭的潜在干预靶点。