乙型肝炎病毒激活NK细胞TRAIL信号通路促进肝细胞凋亡的分子调控机制

Recent data report that NK induced nonspecific immunity damage was involved in the mechanism of viral hepatitis and more and more researchers paid attention to it. TRAIL signal pathway activated in NK cells induced the apoptosis of HBV infected hepatocytes, but not of non-infected hepatocytes. TRAIL and TRAIL receptors (DR5) were expressed highly in infected NK cells and hepatocytes, and their expression was associated with the degree of severity of liver failure. Our previous research showed that HBV encoding proteins, HBx and HBc, induced expression of fgl2 gene related with liver failure and increased the necrosis of liver cells. However, the molecular mechanism under HBV proteins inducing activation of TRAIL/DR5 gene remains unclear now. We aim to investigate the molecular mechanism of highly expression of TRAIL/DR5 and find their transcription factors and cis-elements involved it. Our research will illuminate the complex relation between HBV and immunity cells, HBV proteins and host genes. It will clarify the molecular mechanism of apoptosis in hepatocytes induced by HBV. Therefore, new targets for gene therapy of liver failure may be found from this project.

近年来，NK细胞介导的非特异性免疫损伤在病毒性肝炎发病机制中的作用越来越受到重视，NK细胞表面TRAIL信号通路的激活可特异性地诱导感染肝细胞凋亡，而对未感染肝细胞不发挥促凋亡作用。TRAIL及其受体DR5分子在乙型重型肝炎患者NK细胞及肝组织中高度表达，且与疾病的严重程度密切相关。我们前期研究显示乙型肝炎病毒HBV的编码蛋白HBx和HBc可激活重型肝炎相关的凝血酶原酶基因，促进肝细胞坏死。而HBV病毒蛋白如何影响凋亡相关基因TRAIL及其受体DR5的表达及肝细胞凋亡,其内在分子机制目前还不清楚。本课题将深入研究HBV 病毒蛋白对NK细胞TRAIL /DR5信号通路的影响及分子调控机制，其转录激活所必需的顺式作用元件和反式作用因子，意在揭示病毒与免疫细胞，病毒蛋白、细胞因子与宿主基因表达之间的关系，揭示重型肝炎肝细胞凋亡发生发展的分子发病机制，为重型肝炎分子治疗提供新的靶点和理论依据。

凋亡相关基因TRAIL和其受体DR5在感染的NK细胞和肝细胞高度表达，并且与肝衰竭程度相关，但其高度表达的分子机制尚不清楚。（1）我们发现重型乙型肝炎患者外周血及肝组织中TRAIL和DR4、DR5基因等基因表达较慢性重度乙型肝炎和健康对照组明显增强。（2）成功地构建了TRAIL 基因以及DR4、DR5基因启动子荧光素酶报告基因质粒，分别将其与实验组前期构建的HBV病毒蛋白HBc、HBx和HBs表达质粒进行共转染，发现HBV的HBx蛋白可以激活TRAIL基因以及TRAIL基因的受体DR5基因高度表达。（3）成功地构建了依次裁截的系列TRAIL 基因和DR5基因的启动子荧光素酶报告基因质粒。将一系列裁截启动子荧光素酶报告基因质粒与HBV病毒蛋白真核表达质粒共转染，确定了TRAIL基因和DR5基因的关键调控区域，在病毒蛋白HBx作用下，TRAIL基因的-89位至-29位之间存在着重要的调控序列，DR5基因启动子的-121至-10之间存在着重要的调控元件。（4）通过生物信息学软件（TESS 和 TFSEARCH）分析该区域内候选顺式作用元件位点，通过定点突变实验、凝胶迁移试验（EMSA）以及染色质免疫共沉淀试验（ChIP）明确了转录因子SP-1与其顺式作用元件结合，激活了宿主基因TRAIL基因的转录，促进了肝细胞坏死的发生，说明SP-1是HBV病毒蛋白HBx作用下激活TRAIL基因所必需的转录因子。（5）通过Western blotting和免疫组化的方法检测了TRAIL所介导的肝细胞凋亡相关的信号转导分子活性，包括caspase 3,8,9等，我们发现乙型重型肝炎患者肝组织中凋亡相关分子caspase3、8、9的表达较慢性肝炎和健康对照组增强。提示重型肝炎患者凋亡分子的表达明显增强。本研究初步揭示了HBV病毒蛋白HBx介导重型肝炎肝细胞凋亡相关基因TRAIL高度表达以及下游信号途径分子的激活机制，从病毒与宿主相互关系的角度揭示了重型肝炎的分子机制，并为今后的治疗提供了可能的分子靶点。本项目经过四年的研究（从2013年1月至2016年12月），圆满完成了预期课题计划。