中华蜜蜂谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）基因的表达调控及抗氧化功能分析

昆虫抗氧化能力的高低对其自身抗病与抗衰老具有重要影响，谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）参与调控昆虫抗氧化功能是近年来的新发现。本项目以中华蜜蜂为材料，在分离GSTs基因的基础上，首先通过Northern、Western杂交检测及酶活力测定，分析GSTs基因的表达调控特点并确定它们抗氧化能力的强弱；然后分离特定GSTs基因的启动子调控区域，预测相应的调控元件，并且通过启动子缺失分析及活性检测，确定GSTs基因参与调控抗氧化的上游特异性顺式作用元件；最后，采用RNAi及蛋白质组学技术，筛选与GSTs相关的差异性蛋白，并探讨差异蛋白与GSTs之间的关系。所得结果不仅可以明确中华蜜蜂GSTs基因的表达调控特点与抗氧化功能，丰富蜜蜂抗氧化酶的理论体系，而且对于蜜蜂的抗逆、抗病育种具有重要的指导意义和实践价值。

蜜蜂自身防御机制是应对日益严峻的生存考验、发展健康养殖的重要前提。中华蜜蜂对于维护生态系统的平衡，极具经济价值和社会效益，其优秀的抗逆能力受到生物学家的关注。本课题组开展了谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）在不同胁迫处理下中蜂体内的时空表达规律研究，从分子水平上探讨了中蜂自身防御能力与GST的联系。研究结果如下：.（1）克隆了系列GST家族、SOD、氧还蛋白和sHSP基因，序列分析表明：GSTOs 在物种间有较高的氨基酸同源性；GSTs4、GSTD和GSTO2基因5’侧翼序列含有HSF、AP-1、HSF、CREB等抗氧化元件及发育相关转录因子结合位点；GSTZ1含5个外显子；SOD2的50-侧翼区域内存在转录因子结合位点；Hsp22.6基因无内含子，ORF 585 bp。.（2）研究成年工蜂分别在不同逆境胁迫下的GSTs基因表达模式，发现GSTs4对HgCl2处理最为敏感；幼虫期GSTs4可能参与HgCl2胁迫的响应，有助于保护蜜蜂免遭重金属侵害；GSTZ1对温度和H2O2处理呈现出较高的转录水平；GSTS1对热和杀虫剂处理的响应敏感，对CdCl2不敏感外。GSTO1在幼虫和采集蜂的中肠、表皮和飞行肌中高表达，受冷和热刺激1h、3h后表达量显著升高，TBA方法检测冷热刺激导致MDA蓄积，而RNAi后MDA浓度升高同时，也增加蜜蜂对热刺激的敏感性而降低了存活率，过表达处理增加了机体对氧化刺激的耐受性，GSTO1蛋白在体内外均表现了对DNA的保护活性。WB验证了GSTs基因翻译与转录水平表达特性基本一致。. SOD2在幼虫期和蛹期高表达，多种非生物胁迫处理下会诱导该基因的表达，重组蛋白对细胞在体内、外氧化胁迫时起保护作用。Grx1、Grx2主要在黑眼蛹期表达，Trx1则在羽化出房后15d高表达，Grx1和Trx1在脂肪体和表皮组织表达量最高，Grx2在肌肉中高表达，表皮次之；三者受多种非生物胁迫会上调表达，而紫外线会抑制表达；HgCl2处理上调Grx1和Grx2表达而抑制Trx1；RNAi后CAT、POD酶活性、过氧化氢、醛酮类和抗坏血酸盐等代谢产物、GSH/GSSG和NADP+/NADPH有所提高，表明其在抗氧化应激中起到关键作用。Hsp22.6在中肠中表达量最高，在发育阶段转换期间和多种生物、非生物刺激会上调表达，RNAi使中蜂对温度的耐受性显著降低。