中华蜜蜂学习记忆相关基因克隆及差异表达分析

The chinese honeybee, Apis cerana cerana is an important natural resource of China. The experiment is conducted with Apis cerana cerana which is raised in Jiangxi province,we cloned genes implicated in learning and memory (tyr1:tyramine receptor; Nmdar1: N-methyl-D-aspartic acid receptor; GluRA:glutamate receptor) to investigate their differential expression in visual learning, olfactory learning, and in cross-modal interactions between olfactory and visual learning. This research program adresses a need to elucidate learning and memory in Apis cerana cerana along with its underlying molecular mechanisms. We hope that the results of our studies will shed light not only on the basic biology of this organism, but also have practical applications for the rearing and utilisation of Apis cerana cerana.

中蜂是我国重要的自然遗传资源。本研究以江西省定地饲养的中华蜜蜂（Apis cerana cerana）为实验材料，在克隆中华蜜蜂学习记忆相关基因tyr1（tyramine receptor，酪胺受体基因），Nmdar1 (N-methyl-D-aspartic acid receptor，N-甲基-D-天冬氨酸受体基因)， GluRA （glutamate receptor，谷氨酸受体基因）基础上，系统研究中华蜜蜂蜂视觉学习记忆、嗅觉学习记忆、视觉和嗅觉跨模态学习记忆行为特性以及tyr1，Nmdar1和 GluRA 差异表达水平，以此来探索中华蜜蜂学习记忆行为特性及其分子机理。本项目不仅是对中华蜜蜂行为生物学突破和创新，而且对保护和利用我国宝贵的中华蜜蜂资源，有望提供新思路与方法，因而具有重要的研究意义。

通过RT-PCR技术克隆了东方蜜蜂的CREB基因(AcCREB)，并采用原位杂交技术分析了该基因的mRNA在大脑中的分布表达情况。结果表明：该基因mRNA序列全长为890bp，编码240氨基酸残基。经序列比对，与西方蜜蜂CREB基因有98.76%的同源性。而且该基因的mRNA主要表达在大脑蘑菇体的凯尼恩细胞、触角叶的周围细胞、中心体的神经细胞以及髓质与小叶之间的细胞之中。这说明AcCREB基因可能参与了东方蜜蜂的学习记忆过程。.通过RT-PCR技术克隆了东方蜜蜂的2个多巴胺基因(Acdop2，Acdop3)和2个酪氨基因(Actyr1, Actyr2)。采用原位杂交技术分析了这些基因的mRNA在大脑中的分布表达情况。结果表明：以上4个基因mRNA序列长度分别为1474bp、2049bp、1241bp和1270bp，分别编码549、455、297和399个氨基酸残基。这些基因mRNA在大脑的神经细胞中都有表达，且它们在大脑的蘑菇体凯尼恩细胞和触角叶周围细胞区域的表达重叠。以上结果说明这些基因可能通过相互作用进而影响东方蜜蜂学习记忆行为。.采用改装后Y-型迷宫进行行为学实验来研究东方蜜蜂视觉嗅觉双模态学习特性，得到工蜂对黑白光栅的视觉阈值(视觉角度：2.8° -3.8°)和一个相对嗅觉阈值(浓度：50%–25%)。此外，本研究还同时测定了不同训练条件下5个学习记忆相关基因(AcCREB, Acdop1, Acdop2, Acdop3, Actyr1)的相对表达量。结果表明：条件刺激减少到达阈值水平时，东方蜜蜂可以展示跨视觉和嗅觉模态学习记忆的协同共赢，并且这些基因可能对蜜蜂学习记忆过程有重要作用。.通过微卫星技术分析了工蜂嗅觉学习能力与亚家庭的关系，结果表明：同一蜂群中拥有两种不同学习能力的工蜂在各亚家庭的分布差异不显著(P > 0.05)，推测东方蜜蜂嗅觉学习能力与遗传背景无关。. 通过同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)分析了东方蜜蜂嗅觉学习前后大脑蛋白质表达量变化，结果表明：从训练组和非训练组中共鉴定得到2406个蛋白，2组之间间共有147个蛋白的表达量显著差异，其中87个蛋白在训练组中上调表达，60个蛋白下调表达。这说明这些蛋白可能参与了东方蜜蜂的嗅觉学习记忆。