中华蜜蜂小分子热激蛋白基因的功能分析

Stress resistance is considered to be a crucial factor for honeybee population survival and continuity with the natural environment changes. Currently, small heat shock proteins（sHSPs）in insects have to be regarded as a important member in reponse to stress. And the role in resistance to low temperature and pathogenic microorganisms is considered to be a new foundation. However, there is only limited information on sHSPs in honeybee. On the basis of the recent sHSPs results, we found that AccHsp27.6 and AccHsp22.6 are related to the immune regulation in Apis cerana cerana. In this study, we intend to further explore the expression profile, cold and disease resistance level, specific cis-acting elements and transcriptional regulator factors, and specific proteins and their relationships among sHSPs, with methods of Real-time PCR,Western blot, promoter deletion analysis, yeast one-hybrid, High-throughput sequencing, RNAi and proteomics technique. These results not only prove the expression patterns and function of sHSPs at molecular level, but also increase our understanding of theoretical system in resistance to cold and disease. This study is significant for us to develop breeding for disease resistance and stress tolerance.

自然生态环境的变化使得蜜蜂种群面临日益严峻的生存及延续考验。提高蜜蜂抗逆能力是保持蜂群健康发展的重要前提。小分子热激蛋白（sHSPs）是昆虫发挥抗逆作用的主要成员，其具有的抗寒及抗病功能是近年来的新发现。国内外有关蜜蜂sHSPs的研究报道较少。本项目以中华蜜蜂为研究对象，根据我们前期得到的中华蜜蜂AccHsp27.6和AccHsp22.6与免疫系统调控密切相关这一最新结果，利用Real-time PCR、Western杂交、酵母单杂交、高通量测序、RNAi及蛋白质组学等研究技术，分离中华蜜蜂sHSPs基因家族的主要成员，明确sHSPs基因的表达调控特性，分析sHSPs基因的抗寒及抗病功能。通过对sHSPs基因的顺式作用元件、转录调节因子及下游互作蛋白的研究，探索中华蜜蜂sHSPs基因抗寒及抗病的分子机理。所得结果不仅可以丰富sHSPs的理论体系，而且对中华蜜蜂的抗逆改良具有重要指导意义。

中华蜜蜂是我国固有蜂种，在维护生态系统平衡具有重要的社会效益和经济效益，其优异的抗逆性能备受关注。小分子热激蛋白基因（sHSPs）是生物体热应激等逆境胁迫中产生的，具有抵御细胞损伤和生物保护等多种功能的一类小分子蛋白质。sHSPs在蜜蜂抗逆生物学中的研究较少。本研究开展了中华蜜蜂sHSPs基因的分类及其功能分析，阐述了中蜂自身防御能力与HSPs的关系。研究结果如下：.（1）克隆了sHSPs家族AccERR、AccGSTs、AccRBM11、AccDpp等18个基因及其受体基因，发现中蜂与意蜂的sHSPs序列相似度极高，表明该基因家族在两者中进化的保守性。.（2）通过分析目的基因的保守结构域及系统进化关系，根据不同基因的特征对这些基因进行了生物信息学分析、原核表达、多克隆抗体制备、免疫组织化学及酶活性测定等生物学实验。同时研究目的基因在不同发育阶段下的表达调控模式。.（3）通过比对各个功能基因的时空和逆境胁迫下的表达规律，发现该家族成员具有组织部为和发育阶段的时空表达特异性，并且逆境胁迫处理下会上调其基因表达，通过RNA干扰方法将CYP450s基因家族中CYP314A1，CYP4AZ1，CYP6AS5基因沉默，结果发这些基因功能可能与蜜蜂应对外界不利应激有关。此外，通过敲降AccMTNR1A能够降低与低温胁迫应答相关基因的表达；基因沉默技术该基因也会抑制部分抗氧化相关基因的表达，表明该基因对低温胁迫应答机制可能与抗氧化信号通路有关。因此，AccMTNR1A在中华蜜蜂低温胁迫应答生理过程中发挥重要作用。.（4）通过对蜜蜂生物胁迫和非生物胁迫下抗逆生物学领域的研究积累，综述了有关环境对蜜蜂生存的影响和蜜蜂应对环境胁迫的策略，为研究蜜蜂多层次抗逆机制提供参考。