基于代谢中间产物浓度分析的L-丝氨酸合成途径研究

L-serine is a very important amino acid with many applications in pharmaceutica, food and cosmetic industries. However, some metabolic regulation mechanism for L-serine biosynthesis remained unknown. Due to this, this proposal will attempt to determine the concentrations of 31 kinds of intracellular metabolite in L-serine biosynthesis network by a newly-developed high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method. The analysis of these metabolites concentrations upon genetic modifications will contribute to the in-depth understanding of metabolic regulation mechanism of L-serine biosynthesis and identification of the promising engineering targets towards further improvement of L-serine biosynthesis .

L-丝氨酸作为一种重要氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。但微生物体内L-丝氨酸合成所受到的各种调控机制尚缺乏比较深入的探讨， 本申请拟以此为出发点，通过最新发展起来的胞内代谢物二级质谱定量分析技术，测定胞内L-丝氨酸合成代谢网络中31种重要代谢中间产物的浓度； 分析在分子改造L-丝氨酸合成途径前后，这些代谢中间产物的浓度变化规律，探讨微生物合成L-丝氨酸的代谢调控机制，搜寻可能存在的代谢限速节点，从而为进一步理性有效改造L-丝氨酸合成代谢提供理论指导。

L-丝氨酸（L-Ser）作为一种重要氨基酸，已广泛应用于医药、食品、化妆品等行业。而微生物发酵法生产L-Ser凭借原料廉价、产物纯度高等优点受到广泛关注。近年来，国内外学者均尝试对遗传操作简单的大肠杆菌进行代谢工程改造，培育L-Ser高产菌株，但鉴于大肠杆菌合成L-Ser的代谢网络复杂，特别是存在众多L-Ser向其它氨基酸转化的途径，导致目前文献报道的大肠杆菌发酵法L-Ser最高产量仅为约11.7 g/L。本研究以E.coli W3110为出发菌株，通过理性与非理性相结合方式优化L-Ser的合成代谢，探索了L-Ser的代谢中间产物测定方法，具体研究内容如下：.1..利用定点突变方法解除L-Ser对serA编码的磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制，将serA突变基因与pgk、serC和serB依次插入至表达质粒pSC，构建质粒pSC-05。.2..敲除E. coli W3110基因组上编码丝氨酸脱水酶的基因sdaA；进一步通过随机突变方式，筛选获得了比酶活降低的丝氨酸羟甲基转移酶突变基因glyAm获得突变菌株SWCH-05；对菌株E. coli SWCH-05/pSC-05进行发酵罐补料分批发酵，L-Ser最高可积累11.4 g/L。.3..分别敲除E. coli SWCH-05基因组上与L-Ser吸收相关的四个基因sdaC、cycA、 sstT和tdcC，获得四个单基因敲除菌，L-Ser吸收活性测定分析表明，sdaC敲除菌的L-Ser吸收活性与对照菌E. coli SWCH-05相比下降了23.34%；将质粒pSC-05转化至四个敲除突变菌中进行发酵罐发酵，结果表明sdaC敲除菌的L-Ser产量最高达到了16.3 g/L，与对照菌株相比提高了43%。.4..在sstT、cycA、sdaC和tdcC的单基因敲除菌基础上，进一步构建了四个L-Ser吸收基因的11个组合突变菌，L-Ser吸收活性测定分析表明，在双基因和三基因敲除菌中，仅含有sdaC基因敲除突变的菌株表现出L-Ser吸收活性低于对照菌SWCH-05；而当四个基因均被敲除后，菌株L-Ser吸收活性基本降低至零点。将质粒pSC-05转化至11个多基因敲除突变菌中，进行摇瓶发酵实验，结果表明四基因敲除菌的L-Ser产量最高，达到450.58 mg/L，是出发菌SWCH-05（74.98 mg/L）的6倍