弓形虫ROP16蛋白介导人肺腺癌细胞JAK-STAT途径调节其生物表型的研究

Few reports for using molecule of parasites as bioregulators to treat tumor at present.Previous studies showed that Toxoplasma gondii can regulate the phenotype of lung adenocarcinoma cell line A459, we speculate that JAK-STAT pathway is mediated by ROP16 in lung adenocarcinoma through the preliminary experiment and literature. In this study, we are ready to use gene expression profile sequencing and bioinformatics to analysis the change of signal transduction by ROP16 protein of Toxoplasma gondii in human lung adenocarcinoma cell line A549. The type I, type II and type III of STAT ROP16 is overexpressed in A549, then observing the phenotype and the type of STAT which bind with ROP16 in order to search the type of STAT which can be specific binded with ROP16 by RNAi and observe the target and regulation of ROP16. To research the effects and mechanisms of different type of ROP16 on cell apoptosis, cell cycle and invasion of Lung Carcinoma Cell Line A549, so as to clarify the mechanism and adjusting of Toxoplasma gondii ROP16 protein in human lung adenocarcinoma cell, it can be provided a new strategy and new evidence for the biomolecule targeted therapy of lung adenocarcinoma and other cancers.

利用寄生虫作为生物调节剂治疗肿瘤的研究目前缺乏相关分子靶向调控的报道。前期研究工作显示，弓形虫能够调节人肺腺癌细胞A549的生物表型，通过预实验和文献归纳，我们推测这可能和弓形虫棒状体ROP16蛋白介导人肺腺癌细胞的JAK-STAT途径有关。本项目拟利用表达谱测序、生物信息学等手段分析ROP16蛋白在弓形虫感染人肺腺癌细胞A549过程中引起的信号转导变化，进而将type I、type II和type III型弓形虫ROP16蛋白在A549细胞中进行过表达，然后观察其生物表型的变化，以及ROP16蛋白结合STATs的类型，接下来通过RNAi等手段对ROP16明确结合的STATs类型进行基因沉默，研究不同型别ROP16蛋白对人肺腺癌细胞A549凋亡、周期、侵袭等的影响，以期阐明ROP16蛋白调节人肺腺癌细胞生物表型的分子机制，为肺癌或其它癌症的生物分子靶向治疗提供新策略和新的实验依据。

建立弓形虫感染人肺腺癌A549细胞模型，采用NimbleGen 12x135K 微阵列芯片进行基因表达谱分析，结果统一指向Toxoplasmosis引起的共同信号通路，提示这些信号通路可能在弓形虫与人肺腺癌A549细胞互作中发挥重要的作用。针对信号通路相关基因采用Real time PCR进行验证，发现JAK-STAT途径为主要变化机制途径。构建了弓形虫Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的ROP16基因真核表达载体，采用过表达技术，将弓形虫三种类型的ROP16转染至A549细胞中，进行表达谱芯片检测，结果发现，ME49虫株，即Ⅱ型虫株引起的细胞mRNA表达谱与 Ⅰ型 、Ⅲ型明显不同。ME49重组ROP16蛋白转染A549细胞中无p-STAT3和p-STAT6的激活功能，而RH和VEG株ROP16蛋白则具有显著的p-STAT3和p-STAT6激活作用。RH株重组ROP16蛋白能够显著增高ARG1的表达，降低IL-12的表达，而ME49重组ROP16蛋白则显著增高IL-12和iNOS的表达。iNOS的表达升高导致了NO的合成升高，抑制了弓形虫在胞内的增殖。ARG1的表达升高则使得尿素的产量升高，NO的合成降低，有利于弓形虫在胞内的寄生和增殖，这可能与ROP16蛋白也能够介导RH株、ME49株对巨噬细胞的抗性有关。针对A549细胞表型的变化，我们分别针对周期和凋亡进行了检测，发现ROP16转染A549细胞后，对细胞周期和凋亡并无显著影响。综上，本课题研究了不同类型ROP16蛋白对人肺腺癌细胞生物表型的调节，进而对JAK-STAT途径调节其生物表型的分子机制进行了探讨，发现ROP16蛋白在RH和VEG虫株中可以直接参与STAT3/6的磷酸化水平，引起JAK-STAT信号通路下游相关因子的变化，介导了弓形虫在胞内的生长与增殖。因此，本课题研究成果对利用寄生原虫虫体蛋白调节肿瘤细胞生物表型具有一定的应用价值，并初步阐明了其可能的分子机制。