L-组氨酸代谢支路途径关键酶基因克隆及催化功能分析

L-组氨酸到L-谷氨酸代谢是生物体内一碳单位的主要来源之一。但从4-咪唑酮-5-丙酸开始，还存在一条经由海因-5-丙酸、L-氨甲酰谷氨酸到L-谷氨酸的支路途径。本项目拟利用海因酶或氨甲酰水解酶中高度保守性序列设计引物，通过分子生物学的方法（如基因组步移等），从自行筛选的Streptomyces. sp CW22中获得L-组氨酸降解支路途径两步水解酶的基因，特别是羧乙基海因酶的结构基因；通过与现有环酰胺水解酶的基因比对，进行同源性分析，确定羧乙基海因酶分类；对羧乙基海因酶进行酶学性质研究，结合已有的多种内酰胺化合物、海因环衍生物资源，确定其底物特异性；采用同源建模的方法模拟羧乙基海因酶三维结构、与多种底物进行分子对接，结合底物谱的实验数据，探索羧乙基海因酶的底物适应性识别机制。本项目研究意义在于阐明L-组氨酸代谢支路途径关键酶功能的同时，为其他海因酶定点分子改造和修饰提供相应的基础数据。

本项目以自行筛选的具有羧乙基海因酶活性的产碱杆菌CW221（Alcaligenes sp. CW221）出发，经多次纯化获得电泳纯的羧乙基海因酶，进行N-端测序和肽指纹图谱分析；根据分析结果，设计引物PCR获得的羧乙基海因酶基因；将羧乙基海因酶在E.coli DH10b中进行表达，验证L-组氨酸代谢支路途径中羧乙基海因酶活性；考察羧乙基海因酶的各种酶学性质，特别是结合多种海因底物和羧乙基海因衍生物进行羧乙基海因酶的底物适应性研究。以同源建模的方法构建海因酶的三维结构模型，并对酶分子的功能结构域进行详细的分析。在酶分子静态三维结构模拟和分析的基础上，利用分子对接方法研究海因酶和各种底物分子的识别过程及规律，并应用海因共保护的方法制备出系列γ-谷氨酰化合物及小肽。同时根据二氢乳清酸酶基因的保守序列设计引物，从Alcaligenes sp. CW221中克隆二氢乳清酸酶基因并表达，应用二氢乳清酸共保护的方法制备出系列σ-天冬氨酸小肽。