基于一碳单位代谢途径重构的谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的代谢工程研究

L-丝氨酸在细胞代谢中具有重要的生理作用，在医药领域有广泛的应用前景，但是国内尚无法实现L-丝氨酸的直接发酵生产，亟需开展L-丝氨酸的代谢工程研究，构建基因工程菌，突破丝氨酸发酵生产的瓶颈。谷氨酸棒杆菌是重要的工业氨基酸生产菌种，我们前期对该菌的研究发现L-丝氨酸的分解代谢为细胞提供生长必需的一碳单位，代谢物质流量在丝氨酸和一碳单位之间的分配成为制约L-丝氨酸积累的关键。本项目利用基因工程技术将大肠杆菌中甘氨酸裂解系统整合到谷氨酸棒杆菌基因组，为其提供新的一碳单位供应途径，减弱胞内丝氨酸的分解代谢。通过对细胞生长、生理代谢、蛋白质组表达、丝氨酸羟甲基转移酶活性的研究，分析一碳单位代谢途径的重构对于细胞生长代谢和丝氨酸积累的影响，阐明胞内丝氨酸和一碳单位之间代谢调节机制。本研究将为优化代谢载流模式进行L-丝氨酸的代谢工程改造提供科学依据，为工业微生物育种提供新的理论基础和实践经验。

丝氨酸在细胞代谢中具有重要的生理作用，参与多种氨基酸、嘌呤、嘧啶和磷脂的合成，代谢转运速度快；同时丝氨酸是胞内一碳单位的直接供体，其在glyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的催化下，分解产生甘氨酸，为细胞生长提供所需的一碳单位，使丝氨酸积累困难，导致国内尚无法实现丝氨酸的直接发酵生产。本项目从解决胞内丝氨酸代谢和一碳单位代谢之间供需平衡的角度出发，通过对胞内一碳单位代谢途径的重构，突破丝氨酸直接发酵法生产的瓶颈。通过敲除转录激活因子glyR和使用弱启动（Phom）进行调节的方式，降低了glyA基因的转录水平，导致SHMT的比活力降低了73.6%，成功地将丝氨酸积累量提高了5倍。在此基础上，利用基因工程技术将大肠杆菌中甘氨酸裂解系统（GcvTHP）整合到谷氨酸棒杆菌基因组，通过蛋白印迹杂交分别检测到GcvTHP三个蛋白的表达。通过13C标记的甘氨酸示踪试验，经质谱鉴定获得比鸟嘌呤和腺嘌呤m/z大 1 Da的准分子离子峰，证明甘氨酸裂解系统能够使重组菌分解利用甘氨酸，为腺嘌呤和鸟嘌呤的合成提供所需的一碳单位，满足细胞生长。在生理水平上，glyA基因表达减弱，造成了胞内丝氨酸浓度的提高和甘氨酸浓度的下降，使胞内一碳单位的供应减少，导致胞内的腺嘌呤和鸟嘌呤浓度下降，降低了菌体的比生长速率和葡萄糖消耗速率。GCV系统的导入能够分解胞内的甘氨酸使其维持在较低的水平，胞内的腺嘌呤和鸟嘌呤浓度相应提高，菌体的比生长速率和葡萄糖消耗率得到恢复。蛋白质组学分析揭示了细胞如何应对胞内一碳单位代谢循环产生的扰动，细胞通过增强四氢叶酸、10-甲酰基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸之间的相互转换实现一碳单位的循环利用。摇瓶发酵实验证实glyA基因表达弱化促进丝氨酸的产量，而GCV系统的导入进一步提高丝氨酸的产量和转化率。本项目成功通过一碳代谢途径的重构解决了抑制丝氨酸积累的瓶颈问题，所构建的丝氨酸工程菌在7.5-L小试发酵水平，最高产酸量达到13 g/L，已初步达到了可产业化应用的水平。