内毒素血症瘀滞络脉的骨架重构机制及川芎嗪的保护作用

The permeability increasing of endothelial barrier in endotoxemia is the key link between PMNs' migration to extravascular tissue and inflammatory cascade; recent study found that tetramethylpyrazine (TMP) can reduce the disorder. Collateral disease theory and the updated guidelines also suggest that "Collaterals Damaged by Toxic Stasis" (YuZhiLuoMai) is the important typical lesion site of endotoxemia. Evidently, collaterals' damage and permeability increasing is attributed to cytoskeleton remodeling, but the details of its mechanism are not clear. In this project, we focus on topics as follows: to evaluate the protective effects of positive and negative regulators (calpeptin, Fasudil) and TMP on vital organs in endotoxemic mice and HUVEC with LPS by immunohistochemistry, Western-blot, Realtime-PCR and transwell etc. at different levels, to investigate the dynamic changes in ECs' cytoskeleton and its relating cellular signal transduction, to discuss their cytoskeletal mechanism, to reveal the modern molecular biology foundation of "YuZhiLuoMai" hypothesis on endotoxemia pathogenesis. This study helps clarify the mechanisms of TMP to treat endotoxemia with YuZhiLuoMai from a new perspective and provides theoretical and experimental basis for inventing novel drugs to treat endotoxemia with YuZhiLuoMai.

内毒素血症时血管内皮屏障通透性的升高，是中性粒细胞外渗至血管外组织、触发炎症级联反应的关键环节；新近发现中药单体川芎嗪对此具有保护作用。基于络病学理论，参照最新诊疗指南可知，"瘀滞络脉"是内毒素血症的重要病位特征。既往及前期研究都提示，络脉受损、内皮通透性升高，可归因于细胞骨架重构，但具体机制未明。因此，本项目运用免疫组化、Western-blot、Realtime-PCR、transwell等技术，多水平、多层次分别观察骨架重构正负调节剂(calpeptin、法舒地尔)及川芎嗪对小鼠内毒素血症模型、内毒素刺激内皮细胞模型的作用,对比分析实验各组内皮细胞骨架蛋白及其相关信号分子和效应指标的动态变化，探讨内毒素血症骨架重构及其防治机制，丰富和完善其"瘀滞络脉"理论。本研究将从新的视角阐明川芎嗪对内毒素血症瘀滞络脉的保护作用机制，为研发防治内毒素血症的新药提供科学依据。

脓毒症多为内毒素血症，是现代急诊医学面临的一个常见而复杂的难题，为全身性炎症反应综合征甚至多器官衰竭的前期状态，具有高死亡率、高医疗费用的特点。既往及前期研究都提示，络脉受损、内皮通透性升高、“开门揖盗”是内毒素导致全身炎症反应乃至多器官衰竭的必要前提，并且通透性升高可归因于细胞骨架重构，但目前关于内毒素如何影响骨架蛋白的细胞和分子机制尚未完全明确。因此，本项目重点围绕内毒素血症瘀滞络脉急性肺损伤(acute lung injury, ALI)，开展如下研究：(1)我们利用“LPS二次打击”建立ALI模型，从显微结构、氧化损伤、炎症渗出等方面观察LPS对大鼠肺组织损伤情况；使用高、低剂量的川芎嗪对大鼠进行处理，观察川芎嗪对ALI的保护作用；使用qPCR及western-blot技术通过检测Rho/ROCK的mRNA及蛋白的表达初步探讨川芎嗪对ALI保护的分子机制。(2)建立LPS诱导HUVECs损伤模型，探讨川芎嗪对内皮细胞损伤的保护作用以及川芎嗪干预Rho/ROCK信号通路的具体分子学机制。结果显示：(1)与对照组动物比较，LPS组肺组织水肿明显。肺湿/干重比、MPO活性及MDA含量均明显增加，RhoA及ROCK2mRNA和蛋白表达及p-MLC蛋白表达均显著性升高。与LPS组比，川芎嗪治疗的两组各项指标均减轻，低剂量与高剂量川芎嗪两组间没有明显差异。(2)与对照组细胞相比，LPS组F-actin形态学发生明显改变。TMP组细胞形态明显好于LPS组。与对照组相比，LPS组RhoA、ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白及RhoA、ROCK2和p-EzrmRNA表达均显著升高；与LPS组相比，TMP三组RhoA蛋白表达与mRNA表达均无显著差异，且TMP三组之间RhoA的表达也无显著差异，ROCK2、p-MLC和p-ERM蛋白及ROCK2、p-EzrmRNA表达均明显降低，且TMP三组之间ROCK2、p-MLC和p-ERM的分子表达均有显著差异。因此，Rho/ROCK/MLC和Rho/ROCK/ERM通路可能参与了LPS引起的瘀滞络脉急性肺损伤的病程，川芎嗪可能通过降低ROCK2、p-MLC和p-ERM分子的表达、改善VEC骨架重构、对受损的内皮细胞起到保护作用。本项目的完成为临床通过改善骨架重构，预防、治疗内毒素血症瘀滞络脉提供理论和实验根据。