rs7205289位点多态性与吸烟相互作用对唇腭裂致病微小RNA(miRNA-140)成熟的影响

microRNA（miRNA）已被证实在调节胚胎发育和疾病发生过程中具有重要作用。miRNA-140在唇腭发育中的调控作用与其是否能正常成熟密切相关，有研究发现它的成熟受到其编码基因上rs7205289位点多态性和环境暴露因素（吸烟）的影响。本课题拟在检测胎鼠唇腭发育过程miRNA-140表达情况的基础上，通过病例-双亲对照研究寻找rs7205289多态性、环境因素（吸烟）与人类先天性唇腭裂发生的相关性；并进一步培养胎鼠腭间充质细胞，构建miRNA-140慢病毒表达载体，制备香烟烟雾提取物，将miRNA-140表达载体和香烟烟雾提取物两种因素共同/分别作用于腭间充质细胞，检测细胞中miRNA-140表达情况。最后综合遗传流行病学统计分析和生物学实验的结果，阐明rs7205289位点多态性和吸烟相互作用影响miRNA-140成熟的机理，为寻找唇腭裂预防和基因治疗的靶点提供依据。

MiRNA是一种短小的、可调节蛋白表达的内源性单链RNA分子，其在胚胎发育和疾病发生中发挥重要作用。 研究发现，颅神经脊间充质细胞中的miR-140可以通过调控pdgfra调控调控斑马鱼的腭发育。条件性敲除小鼠颅神经脊细胞中的pdgfra，会抑制腭间充质细胞胞外基质分泌关键基因MMP2表达，而导致小鼠腭裂。MiR-17-92 miRNA家族（包括miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, 和 miR-92a-1）在腭板生长和上抬的时期在小鼠胚胎的第一腮弓部位表达，并且在多个细胞系中，可以靶向作用于TGFB通路中的多个蛋白成员。而TGFB通路是腭间充质发育过程中最重要的通路之一,调控着腭间充质细胞的增殖和胞外胶原分泌。MiRNA在调控蛋白表达的同时也受到其他因素的调控，例如miRNA编码基因上的多态性位点可能影响miRNA的成熟和表达。我们的研究目标是分析miR-140和miR-17-92在腭间充质发育过程中的作用，相关miRNA编码基因上是否有多态性位点会影响其成熟进而影响腭发育。我们采用miRNA原位杂交、实时定量PCR、western blot、luciferase reporter assay等方法发现，Pdgfra在腭间充质细胞中是miR-140的靶基因, 且miR-140通过靶向抑制pdgfra下调了腭间充质细胞中MMP2的mRNA和蛋白表达水平,但没有影响细胞增殖率。miR-17-92可调控TGFB1诱导的腭间充质细胞增殖和胞外胶原的分泌。通过单独加入miR-17-92家族每个成员的模拟物我们发现miR-17和miR-20a靶向作用于TGFBR2，miR-18a靶向作用于SMAD2和SMAD4。位于pre-miR-140编码基因上的rs7205289位点A等位基因会联合孕妇被动吸烟这一危险因素影响miR-140的表达，增加了NSCP的患病风险。