乙肝病毒逆转录酶变异位点和多态性位点对HBVDNA复制的影响

课题组前期从4项阿德福韦Ⅲ期临床试验1年共220例慢性乙肝患者中筛选出10例(4.5%）继发性耐药患者，14例（6.4%）原发性耐药患者。测序分析了15株乙肝病毒(HBV)耐药株逆转录酶（RT）区核苷酸及氨基酸序列, 发现5株原发耐药株（35.7%）具有多态性位点rt118H，另外3株继发耐药株具有5处变异位点rtN118T、rtH126Y、rtG131D、rtI271M和rtA222T。拟进一步进行表性确证试验, 即采用定点诱变技术将上述变异位点引入具有自主复制能力, 携带HBV野生株1.3倍基因组质粒中,转染HepG2细胞，然后用多种不同浓度核苷类药物处理HepG2细胞，ELISA法检测上清液HBsAg、HBeAg浓度，Southern杂交检测HBVDNA复制中间体的变化。对无变异位点的HBV耐药株则进一步分析其全基因组序列。阐明HBV变异与HBV临床耐药之间的关系。

前期工作筛选到阿德福韦治疗慢性乙肝继发性耐药患者10例（4.5%），原发性耐药患者14例（6.4%）。在全部24例耐药株中6例（6/14，42.9%）原发性耐药株治疗前后HBV均为多态性位点rt118H，推测多态性位点rt118H可能与HBV原发性耐药有关。.预实验发现HBV 1.3×基因组重组体转染HepG2细胞后复制水平相对较低，Southern杂交检测HBVDNA复制中间体的稳定性较差，多数时候检测不出HBVDNA复制中间体。虽然经过改良的向下转膜Southern杂交检测，其结果也并不令人满意。HBV 1.3×基因组较低的复制水平可能与HepG2细胞转染效率较低，或HBV自身核心启动子在体外启动活性较低有关。.Zoulim等及Yang等分别建立了一种HBV1.1倍体构建方法，这两种方法已在一些研究中被用来进行HBV体外表型分析。虽然多数情况下，这两种方法都很有效，但在某些情况下，仍不太适用或不够简便。在本部分研究中，我们建立了一种全新的HBV1.1倍体构建策略，利用该策略构建HBV1.1×基因组重组体。该重组体由CMV启动子驱动HBV前基因组RNA（pgRNA）转录，可以实现较高水平的HBV体外复制。.该策略的基础是即片段置换反应（FSR），其优点是可以绕过酶切连接步骤，将DNA片段插入载体。FSR方法在很多情况下(例如没有合适的酶切位点时)，较传统酶切链接克隆方法更为灵活有效，由于这一特点，该方法在分子生物学研究方面有广泛应用前景。基于FSR，我们发展了一种新的体外可复制HBV1.1倍体构建策略，该策略允许我们很方便地从患者血清样本HBV DNA构建HBV1.1×重组体，从而大大方便了HBV表型分析相关研究。利用该策略，我们对一例ETV部分反应患者，及三例ADV治疗反应不佳患者血清HBV进行了表型分析，首次证实含有RT S246T变异的HBV对ETV仍然敏感，而含有RT N118H变异的HBV对ADV也仍然敏感，RT aa246及RT aa118位点在ETV及ADV耐药中的作用较小，提示当患者出现aa246及aa118突变时，使用ETV及ADV治疗仍然有效。.成果：发表SCI论文2篇,CSCD论文1篇