miRNA靶基因3'UTR内SNP对结直肠癌发病的影响及其后续功能分析

遗传因素是导致结直肠癌发病的重要因素，以往研究已经发现多个相关基因中的单碱基多态性（SNPs）与结直肠癌发病的相关性，但SNPs影响相关基因表达而导致结直肠癌发病的机制仍不清楚。近期研究表明，miRNA靶基因3'UTR内存在的SNPs可影响miRNA与靶基因结合而导致基因表达失调。为了解miRNA靶基因内3'UTR的SNPs是否以及通过何种机制参与了结直肠癌的发病，本项目拟①利用生物信息学技术初步筛选结直肠癌发病相关基因中可与miRNA结合的3'UTR端存在的SNPs，结合高通量焦磷酸测序对所得SNPs进行初步验证；②利用SNPs分型找出病例及对照中存在显著性差异的SNPs；③对所得SNPs对于相关基因的表达影响进行分析。尝试阐明miRNA靶基因3'UTR内SNPs对结直肠癌发病的影响机制，为研发新的结直肠癌诊断治疗手段提供科学基础。

近期研究表明，miRNA靶基因3’UTR内存在的SNPs可影响miRNA与靶基因结合而导致基因表达失调。为了解miRNA靶基因内3’UTR的SNPs是否以及通过何种机制参与了结直肠癌的发病，本研究通过生物信息学及高通量焦磷酸测序筛选出CD86 rs17281995、IL-16 rs1131445、GHR rs2973016、INSRrs1051690、IL1A rs3783553、APC rs397768以及KRAS s712等七个在病例组与对照组之间分布频率有显著差异的SNPs。在用RFLP对每一样本的具体基因型进行确定后，我们发现：CD86 rs17281995中GG基因型和G等位基因与结直肠癌发病相关；KRAS rs712 中TT基因型和T等位基因明显增加结直肠癌发病率；IL-16 rs1131445中TT基因型和T等位基因是结直肠癌发病的危险因素；INSR rs1051690中GG基因型和G等位基因对结直肠癌发病具有保护作用。对KRAS rs712和IL-16 rs1131445的功能验证中我们发现：在KRAS rs712的功能检测中，突变型（T）和空白3’UTR结合区的转染细胞在目的基因KRAS的荧光表达上强于野生型（p=0.011），而在肿瘤样本的mRNA和蛋白表达上，T基因型强于G基因型（ p=0.033, p=0.018）。在IL-16 rs1131445的功能检测中，突变型（C）和空白 3’UTR结合区的转染细胞在目的基因蛋白的表达上弱于野生型（ANOVA, p=0.047），尽管肿瘤样本的IL-16 mRNA两组并无显著性差异（p=0.332），但IL-16蛋白表达两组之间仍有显著性差异（p=0.021）。本研究表明，位于miRNA 3’UTR结合区的SNPs与结直肠癌发病具有相关性，KRAS rs712可能通过影响miRNA与KRAS mRNA结合导致KRAS mRNA无法降解导致KRAS基因异常高表达导致肿瘤发生，而IL-16 rs1131445对IL-16的影响主要表现在蛋白表达水平，对基因转录并无影响，可能机制是由于 rs1131445影响了miRNA与IL-16mRNA结合，从而抑制IL-16表达。