LINC00673通过调控Mex3b介导的NR3C2泛素化促进肾癌恶性进展的作用研究

The role of abnormal ubiquitination and long noncoding RNA in progression of renal cell carcinoma is not fully clear. We previously have confirmed the NR3C2 as a suppressor in renal cell carcinoma, and can inhibit the malignant phenotype of renal cancer cells such as the cell growth and invasion. We previously found that LINC00673 can promote the ubiquitination and degradation of NR3C2. What's more, LINC00673 can directly bind to NR3C2 and Mex3b protein, a E3 ubiquitin ligases, and can promote the malignant phenotype of renal cancer cells. What’s more, knockdown of Mex3b can inverse the protein level of NR3C2 regulated by LINC00673. Therefore we hypothesized thatin RCC, LINC00673 could induce the ubiquitination of NR3C2 by function to Mex3b (such as LINC00673 as a scaffold to enhance the interaction of Mex3b and NR3C2) and then enhances the tumorigenesis and metastasis of RCC,however,the detail interaction mechanism of NR3C2-LINC00673-Mex3b 2 should be further studied and confirmed. In our grant, based on our previous data we would confirm and reveal the above hypothesis via intro and vivo model，and clinical samples, and provide a potential therapeutic targets for the clinical treatment of renal cancer.

异常泛素化作用和长链非编码RNA在肾癌进展中的作用尚未完全清楚。既往我们已证实NR3C2作为抑癌基因可抑制肾癌细胞的生长、侵袭等恶性表型。进一步前期研究发现LINC00673可以明显降低NR3C2的蛋白表达水平，促进其泛素化降解，而且可以结合泛素化连接酶Mex3b和NR3C2，并能促进肾癌细胞的恶性表型。另外沉默Mex3b能逆转LINC00673对NR3C2蛋白的调控水平。因此我们推测LINC00673可能通过某种机制作用于Mex3b（比如作为支架桥梁招募Mex3b，增强Mex3b和NR3C2的结合能力），最终促进NR3C2的泛素化降解，从而参与了肾癌恶性进展的调控，但NR3C2-LINC00673-Mex3b三者间相互作用的具体机制仍需进一步验证。本项目拟在前期工作基础上，通过体外、体内模型、临床标本，进一步验证并阐释上述假设，从而为肾癌的临床治疗提供新的潜在干预靶点和实验依据。

目前肾癌发生发展的机理尚未完全清楚，我们前期发现LINC00673可促进肾癌细胞的恶性表型，具体机制不明。本课题通过临床标本，并构建过表达及基因沉默LINC00673、Mex3b质粒，及RIP和Co-IP的免疫共沉淀、及泛素化作用等实验方法，得出以下结果： a. 收集119例肾癌及癌旁组织行LINC00673的PCR定量，发现肿瘤组织高表达，且和肿瘤T分期存在一定关系，T3期明显高于T1期，T2期的表达水平介于T3及T1期之间。b.LINC00673促进肾癌细胞增殖、克隆形成及侵袭力，促进E-Cadherin/Vimentin/MMP2的表达，抑制NR3C2的蛋白水平。c.通过蛋白合成抑制剂CHX 处理后，过表达LINC00673细胞的NR3C2蛋白的半衰期明显缩短，而通过蛋白酶抑制剂MG-132处理后，过表达LINC00673细胞的NR3C2蛋白的水平明显增加，提示过表达LINC00673对NR3C2的泛素化调控作用。d.过表达LINC00673后，NR3C2的泛素化水平增加。NR3C2可逆转LINC00673对肾癌细胞恶性表型的调控。e.分子机制发现RNA免疫共沉淀证明LINC00673可以直接结合Mex3b蛋白，且能促进Mex3b蛋白的表达，基因沉默Mex3b可促进NR3C2的表达，能部分逆转LINC00673对NR3C2蛋白及肾癌恶性表型调控的影响。f.过表达LINC00673后，通过蛋白间免疫共沉淀实验方法，发现Mex3b和NR3C2蛋白结合能力增强。最后发现沉默Mex3b后NR3C2泛素化降解减弱。目前动物实验因动物饲养及疫情延误的影响，实验正在进行中。细胞实验初步揭示LINC00673-Mex3b-NR3C2信号轴在肾癌进展中的作用机制。