基于前药策略的人造TPT3-NaM碱基核苷酸跨膜转运系统的构建及活性研究

Influenza virus is one of the major threats to human health, which can infect a wide range of hosts. Seasonal epidemics cause about 600 million people infected worldwide annually, and lead to the death of 250-500 thousand people. The use of gene coding technique for modifications of influenza viruses is a promising approach for researches on the mechanisms of viral infections and manufactures of new virus vaccines. The efficiency and fidelity of artificial genetic code is the key for the development of the new gene coding techniques. Recently, we synthesized an artificial TPT3-NaM base pair, which was found as the most effective artificial genetic code so far. TPT3-NaM base pair is expected to be used for the construction of artificial influenza virus based on the modifications of virus gene with TPT3-NaM as unnatural base pair. This project aims to construct a new delivery system of this kind of artificial base pair TPT3-NaM and an evaluation system for the retention efficiency of the unnatural base pairs after transfections in vivo. This will supply a useful chemical biological tool for the investigation of virus duplications in host cells and offer new methodologies for the development of influenza virus vaccines.

流感病毒严重威胁人类健康，能感染广泛宿主，每年全球约6亿人感染，导致数十万人死亡。利用非天然基因编码技术改造流感病毒有望为病毒感染分子机制研究、新型病毒疫苗创制提供全新的研究工具。具备优良生物正交性和复制/转录效率的人造基因密码是非天然基因编码技术的关键化学基础。本项目团队成员合成了迄今活性最高的人造碱基对TPT3-NaM，有望作为非天然基因密码用于人工改造流感病毒。将TPT3-NaM核苷酸有效转运至宿主细胞是其应用的前提及关键科学问题。本项目拟利用前药策略构建TPT3-NaM核苷酸输送系统。采用已成功用于核苷酸类前药如索非布韦等的转运基团修饰TPT3-NaM核苷酸合成系列前药并研究其跨膜活性，筛选高效地转运并在细胞内代谢释放出TPT3-NaM核苷酸的前药分子。该项目的实施，有望为阐释流感病毒在宿主细胞中复制分子机制提供全新的生物学工具，为新型流感病毒疫苗的开发提供方法学基础

具备优良生物正交性和复制/转录效率的人造基因密码是非天然基因编码技术的关键化学基础。F. E. Romesberg等合成了迄今活性最高的人造碱基对TPT3-NaM，有望作为非天然基因密码用于人工改造流感病毒。将TPT3-NaM核苷酸有效转运至宿主细胞是其应用的前提及关键科学问题。本项目拟利用前药策略构建TPT3-NaM核苷酸输送系统。采用已成功用于核苷酸类前药如索非布韦等的转运基团修饰TPT3-NaM核苷酸合成系列前药并研究其跨膜活性，筛选高效地转运并在细胞内代谢释放出TPT3-NaM核苷酸的前药分子。通过该项目的实施，取得了如下进展：（1）发展了非天然碱基核苷TPT3和NaM碱基核苷的克级规模制备方法；（2）完成了40个磷酸氨酯类和2个正十六烷氧丙基磷酸单酯类以及3个磷酸双酯类目标化合物的合成及表征工作;（3）测试并总结了40个磷酸氨酯类和2个正十六烷氧丙基磷酸单酯类衍生物分子的膜渗透活性、血液稳定性、细胞毒性、抗肿瘤及抗菌活性研究工作；（4）初步构建了TPT3和NaM碱基核苷酸输送系统；（5）发展了一种基于桥梁碱基的对于包含多个TPT3-NaM非天然碱基对DNA的准确测序方法，并利用该方法测定了SSO复制过程中多个TPT3-NaM在质粒中的保留率，并揭示了造成UBPs突变的可能原因，从而为包含多个TPT3-NaM碱基质粒的复制能力的体外测评提供了首个有效途径，并且通过酶促的TPT3-NaM碱基插入AP位点，然后使用isoTAT介导的PCR对其精确位置进行定位，实现了对于包含多损伤位点的DNA样本的测序；（6）对项目实施过程中发现的一些新的实验现象开展了深入研究，取得了有意义的结果：首次设计合成了两亲有机小分子四苯乙烯-半乳糖缀合物通过自组装微囊泡用于可视化和靶向药物递送；构建了首例半乳糖-四苯乙烯有机两亲小分子囊泡载药体系； 设计合成了一类吡啶并嘌呤酮结构的新型有机可见光催化剂并用于高效合成活性胍类化合物等。