反式自主转运蛋白离体重组系统的构建及其跨膜转运机理研究

Although inversed autotransporter is one of the pathways that are used by pathogenic bacteria to secrete virulence proteins, its molecular mechanism is unfortunately still poorly understood. It is the aim of this proposal to set up an in vitro assay for inversed autotransporter in order to pursue an in-depth investigation based on the experiences of the applicant who successfully developed the first versatile in vitro assay for beta-barrel membrane proteins. The molecular details that if BAM is involved in the inversed autotransporter translocation, and if so the detailed mechanism, will be investigated.To investigate how BAM interacts with inversed autotransporters on its secretion process as well as how the BAM components interact with each other to mediate the inversed autotransporter translocation, photo-cross linking, the most powerful protein-protein interaction analysis method, will be used. The translocation path of the inversed autotransporter and the real composition of the translocation pore will be examined in order to enable a fully understanding of the molecular mechanism of the biogenesis of inversed autotransporters, which can be further applied for various clinical and biotechnological purposes.

在我国发布的“遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)”中，要求加大基础研究力度，阐释细菌的致病机制。反式自主蛋白转运系统是革兰氏阴性病原菌分泌病原蛋白以致病的重要手段之一，但人们目前对其详细作用机理，则知之甚少。本课题拟在申请人所开发的首个通用型外膜蛋白离体转运研究系统的基础上，首先着力构建反式自主转运蛋白的离体研究系统，并深入研究BAM蛋白复合体是否参与了反式自主转运蛋白跨细菌外膜的转运过程，进一步阐明其详细作用机理。并拟使用定点光交联技术研究BAM蛋白复合体各组分间及其与反式自主转运蛋白相互作用关系的动态图谱，以解析反式自主转运蛋白跨膜转运的详细路线，并进一步阐明反式自主转运蛋白跨外膜转运的通道组成, 进而揭示反式自主转运蛋白跨外膜转运的新机理，从而为病原微生物的致病机理、临床防治，以及开发以反式自主转运蛋白为工具的生物工程新产品提供指导。

项目背景：.在我国发布的“遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)”中，要求加大基础研究力度，阐释细菌的致病机制。反式自主蛋白转运系统是革兰氏阴性病原菌分泌病原蛋白以致病的重要手段之一，但人们目前对其详细作用机理，则知之甚少。..研究内容：.（1）大肠杆菌BAM复合物中各组分在转运过程中的功能检测；（2）利用定点光交联技术描绘相互作用图谱；（3）BAM核心组分BamA和BamD为靶点的天然产物的筛选；（4）BAM复合物功能的简化形式研究；（5）AT表面展示载体在疫苗中的初步应用。（6）.天然产物大规模制备技术的研发。..重要结果：BAM复合物的核心组分BamA和BamD能在其他组分不存在的条件下，完成对外膜蛋白的插膜、AT的转运；分析分子伴侣在FhaB分泌过程中的作用及二者之间的相互作用；单个BAM蛋白TtOmp85能发挥类似大肠杆菌中BAM复合物的功能；利用AT展示了HPV抗原片段；在国内外首次提出三区带异步切换SMB技术，并成功分离结构类似物香兰素与丁香醛。项目执行期间，已发表论文7篇。其中SCI论文4篇，撰写专利1篇，目前正在提交中，接受论文1篇。..关键数据：建立了反式AT的体外转运体系，摸索出大量纯化BAM蛋白的方法，并优化了储存蛋白的缓冲液成分，制备了大量的BamA、FhaC蛋白的突变体，筛选得到了靶向BamA和BamD的天然产物，并建立了三区带异步切换SMB技术，构建了AT的表面展示系统。..科学意义：发现TtOmp85单个蛋白即可替代E. coli中由BamA-E五个蛋白所组成的BAM蛋白复合体，为阐明BAM蛋白复合体中核心蛋白的功能及其作用机理等提供极大的便利，从而加速以BAM蛋白复合体为靶点进行相关抗菌药物筛选等工作的进程。另外，构建了基于Ag43的细菌表面展示载体，并利用该系统对HPV抗原进行了展示研究，为其进一步应用在疫苗领域提供基础。建立的三区带异步切换SMB技术为以外膜桶状蛋白为靶点的新型抗生素开发过程中天然产物的大规模分离测试奠定了基础。