苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry5Ba表达沉默的负调控因子及其调控模式

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前世界上应用最为成功的微生物杀虫剂。Bt最主要的杀虫成份为杀虫晶体蛋白(简称Cry)。现有的Bt晶体蛋白基因的调控模式都是针对正调控的，而在新cry基因的发掘和基因组测序过程中发现许多杀虫晶体蛋白是不表达的，说明Bt晶体蛋白的表达存在负调控模式。本课题拟以存在典型cry基因沉默现象的菌株为模式菌，以隐蔽基因cry5Ba为靶标，通过基因突变，表型互补等策略，找到影响Cry蛋白表达的关键负调控因子。进一步通过生物大分子的相互作用分析，解析Cry蛋白或其基因与负调控因子间的相互作用，最终从分子水平上揭示Cry蛋白表达负调控的模式。本课题将从基础理论上丰富对芽胞杆菌表达调控模式的认识,揭示Bt的一种新的cry基因调控模式, 并将对提高晶体蛋白的表达水平进而构建高效杀虫工程菌以及挖掘新型杀虫基因具有重要指导作用。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)主要的杀虫成分为杀虫晶体蛋白(简称Cry)。现有的cry基因的调控模式都是正调控的，而在新cry基因的发掘过程中发现许多cry基因是不表达的，说明cry基因表达存在负调控模式。本课题以存在典型cry基因沉默现象的菌株YBT-1518为模式菌，以隐蔽基因cry5Ba为靶标来研究Bt晶体蛋白表达的负调控因子及其机制，随后又基于基因组数据中Bt的毒力因子及其潜在调控机制进行了发掘和研究。本研究(1) 通过RT-PCR发现cry5Ba的沉默发生在转录后水平；通过缺失实验和克隆表达方法证明了其他cry基因的存在与否和cry5Ba基因的侧翼50kb区域都不会影响cry5Ba的沉默表型；(2) 通过生物信息学从YBT-1518的基因组中预测到一个潜在的sRNA BMBsr1，通过RT-PCR检测到了BMBsr1的转录；(3) 通过构建相互作用模型和EMSA实验证明了BMBsr1可以与cry5Ba mRNA发生相互作用，抑制cry5Ba基因的表达；(4) 通过突变实验明确了BMBsr1是通过其二级结构环上的13个碱基与cry5Ba mRNA启动子区域的RBS结合，从而阻止其翻译，进而抑制了Cry5Ba蛋白的表达; (5) 通过BMBsr1超表达突变株证明了cry5Ba的沉默可以帮助YBT-1518更好地进入宿主肠道并定殖，进而更好地杀死宿主；(6) 测定一些典型Bt菌株的基因组序列，预测到了20个Bt中保守的潜在sRNA，其靶标涉及到多种与Bt生理生化活动紧密相关和毒力相关的基因，验证了数个sRNA的存在，并验证了其中一个sRNA的功能与Bt芽胞形成相关；(7)基于Bt基因组数据，在Bt的毒力因子、细菌素、质粒特征等方面进行了一些拓展研究。本课题首次报道了Bt中的调控sRNA及其负调控晶体蛋白表达的机制，揭示Bt的一种新的cry基因调控模式，并发现了Bt中还存在其他潜在的调控sRNA，同时揭示Bt中sRNA介导的毒素基因沉默能帮助其逃避线虫的防御这一生物学意义，在此之前还没有见到Bt负调控杀虫基因的报道，更未见将杀虫基因的表达调控与病理学以及菌虫互作联系在一起的报道。本课题从基础理论上丰富对芽胞杆菌表达调控模式的认识，以及进一步提升人们对Bt与宿主相互关系的认识。