苏云金芽胞杆菌晶胞粘连必需基因簇scaABCDE在将伴胞晶体定位于芽胞外壁内侧所起的作用

Bacillus thuringiensis forms the parasporal crystals during sporulation. After the mature of sporulation, the crystal is separated from the spore. But in few strain, the crystal forms between exosporium and coat, leading to the connection of spore and crystal at the end of sporulation. This special phenotype was called spore-crystal association (SCA). Our previous work showed that the key factor determining SCA is the gene cluster scaABCDE and crystal protein gene cry26Aa. This work will reveal the role of the gene cluster scaABCDE when positioning parasporal crystal in the inner side of exosporium in Bacillus thuringiensis strain YBT-020. We will dtermine the location relation of the SCA crystal and the exosporium "cap" structure, the location of the ScaA, ScaB and Cry26Aa proteins in the develping spore, the interaction networks of the proteins Cry26Aa, ScaA, ScaB, and the exosporium related protein ExsY, CotE and CotY, the SCA-specific region and its related amino acids in crystal protein Cry26Aa, and whether the ScaC, ScaD, ScaE proteins maintain the stability of the exosporium. Finally we will figure out the SCA mode at the biochemical and subcellular level.

苏云金芽胞杆菌产生的伴胞晶体在芽胞成熟后与芽胞在空间上彼此独立，但个别菌株的伴胞晶体在芽胞外壁内侧形成，产生晶胞粘连现象(SCA)。本课题前期工作发现菌株YBT-020中决定晶胞粘连现象的关键因子为全新的基因簇scaABCDE和晶体蛋白基因cry26Aa。本课题将确定该基因簇scaABCDE在将伴胞晶体定位于芽胞外壁内侧过程中起到的作用，包括确定粘连晶体与芽胞外壁发生时的"帽子结构"的位置关系；确定在芽胞形成过程中ScaA、ScaB以及晶体蛋白Cry26Aa蛋白在芽胞结构中的位置；确定Cry26Aa、ScaA、ScaB以及芽胞外壁形成相关的ExsY、CotE和CotY等蛋白质之间相互作用的关系网络；确定Cry26Aa蛋白中决定粘连的关键氨基酸区段和关键氨基酸残基；验证ScaC、ScaD和ScaE蛋白是否具有维持芽胞外壁稳定性的作用，从而解析晶胞粘连的生化和亚细胞机制。

苏云金芽胞杆菌（Bt）制剂是目前应用最广泛的细菌杀虫剂。大部分Bt产生的伴胞晶体在芽胞成熟后与芽胞彼此分离，也有部分菌株的晶体在芽胞外壁内侧形成并被其包裹，产生晶胞粘连表型(SCA)。本项目以YBT-020菌株为模型，在明确scaAB操纵子为粘连表型控制因子，Cry26Aa蛋白为粘连晶体主要成分的基础上，从多个层面对SCA表型形成机制做出了充分阐述：1）生化分子生物学机制，确定了ScaA和ScaB蛋白自身定位在芽胞外壁“帽子结构”上并通过与Cry26Aa蛋白间直接相互作用决定粘连晶体位置。同时发现粘连晶体蛋白中并不存在被控制的某一关键氨基酸或残基，而是特殊高级结构起到重要作用。2）发育机制：明确了“帽子结构”是形成京胞粘连的关键决定因素，并且“帽子结构”的正确附着决定了粘连晶体的正确定位。3）从芽胞形成的全局角度，明确了晶胞粘连表型具有晶体蛋白特异性，不同SCA菌株的表型控制因子与粘连晶体成分间存在特异对应关系。建立了YBT-020菌株晶胞粘连相关蛋白的互作网络，明确了晶胞粘连表型是多种芽胞外壁结构蛋白共同互作的结果。4）建立了晶胞粘连菌株资源和粘连晶体蛋白基因库。5）证实了晶胞粘连表型对杀虫晶体有保护作用（进一步明确了scaCDE具有稳定晶胞粘连表型的作用），并能有效应对宿主对杀虫晶体的趋避行为。为揭示SCA表型形成机制多样性，寻找不同机制间的共性规律，实现对其他非粘连晶体蛋白或非粘连Bt菌株的改造，开发新型“生物囊”杀虫剂打下了坚实的理论基础并提供了强大的资源素材。