大肠杆菌表达异源蛋白质时的多态性研究

The process and mechanism of in vivo peptide folding is a central topic of biological research. Heterogeneous protein folding and inclusion body formation in bacteria is of particular interest due to its importance in application in bio-industry and basic laboratory research. The traditional techniques for group-level analysis monitor averaged values of those variable characteristics among individual cells, making it difficult to effectively discribe and comprehand the relationship between macroscopic physiological parameters and the corresponding microscopic properties. Our lab established a set of single-cell detecting technique and first found that multiple states of recombinant Escherichia coli. In this work, we will employ a new generation flow cytometer that has high resolution and high sensitivity to investigate the mechanism of different states. Our first aim is to get system information about effects of culture conditions on cell subpopulations distribution. Secondly, compare target protein expression levels, inclusion body formation and gene expression profiles. Third, isolation of improved hosts that can facilitate the expression of Heterologous proteins and folded correctly and have a stable phenotype. Finally, investigate the folding multiple states of proteins other than galactosidase. These findings will provide new information for protein folding mechanisms in vivo.

由于蛋白质自身折叠及细胞生理状态等原因，异源蛋白在大肠杆菌中表达时往往会形成包涵体等无活性状态。传统对包涵体的研究往往是基于群体水平,无法在单细胞水平上跟踪异源蛋白的折叠过程。我们利用流式细胞仪等手段首次发现大肠杆菌在表达异源蛋白时具有多态性。影响包涵体形成的相关因素正是通过改变多态性分布从而引起异源蛋白可溶性的改变。在本研究中，我们将采用新一代更高精确度和灵敏度的流式细胞仪Influx对大肠杆菌在表达异源蛋白质时产生多态性的生物学机理进行进一步研究。我们的研究包括：（1）获取各种培养条件对细胞亚群多状态分布影响的系统信息；（2）比较高活性细胞群和低活性细胞群的目标蛋白表达水平、包涵体形成状态和基因表达谱；（3）筛选获得能够利于异源蛋白高表达及正确折叠并具有稳定表型的突变菌株；（4）对大肠杆菌表达其它模式蛋白质时的多态性进行分析。以上研究结果将为蛋白质细胞内折叠机理提供新的依据。

新近的研究表明同一遗传背景的微生物细胞个体之间在生化、生理、行为等各个方面都表现出广泛的差异。传统的群体水平的微生物分析方法在面对广泛存在的微生物细胞异质性问题时，是无能为力的。群体水平的测量将微生物群体内部差别平均化了，掩盖了个体特征和差异，所得结果往往不能反映真实状况。流式细胞术集中了在单细胞水平高通量、多参数、高精确度和高灵敏度分析功能和高速细胞分选能力，被认为是目前可获得的最佳测量微生物异质性信息的工具。本研究采用新一代的高灵敏度和高分辨率流式细胞仪测量表达异源β-半乳糖苷酶融合蛋白质的大肠杆菌，首次发现10多种特征各异的细菌亚群。本研究中，流式细胞术同时检测前向散射光（反映细菌细胞大小）、90度侧向散射光（反映细菌细胞内部颗粒度）、融合蛋白质水平和β-半乳糖苷酶活性水平。重组大肠杆菌在双散射光图上分布为四个细胞亚群。这四个亚群依据酶活性不同和蛋白质表达水平可分别再分为一至四个次级亚群。这些亚群和次级亚群具有相对稳定性，随着OD值（菌液中细菌细胞密度）、基因表达诱导剂IPTG浓度、培养基pH值和培养温度的不同呈现各具个性的动态变化。各个次级亚群细胞相对于这四个不同生长条件的变化的响应明显不同（譬如对OD值变化和对温度变化的响应截然不同）。这些相对不同生长条件表现出的亚群和次级亚群的个性，反映出这些细胞亚群和次级亚群形成的条件差异。通过研究发现，细菌的光衍射物理性质与细胞中酶活性和融合蛋白质水平之间存在确定而复杂的关系。细菌的这种多态性为筛选出具有个性表型特征的新菌株提供了可能依据。