硫化叶菌Holliday junction解离酶Hje的体内功能与作用机制研究

Holliday junction（HJ）is the hallmarker DNA intermediate of DNA recombinational repair. Cells must process the intermediate properly to fullfill normal chromosomal replication and survive. HJ resolvase is one of the key enzymes and the pathway involved is one of the main pathways processing HJ intermediates. The bacterial resolvase RuvC cleaves HJ　after it is migrated by the complex formed by the helicases RuvA and RuvB. In recent years, resolvases from archaea and eukarya have been identified. However, their detailed cellular functions and mechanisms are still unclear. In this study, we will construct stains of sigle or double deletion of hje, xpf, and others which encode structure-specific endonucleases and the overexpression strains, detect the sensitivity of these strains to DNA damage agents, and analyze the changes in transcription levels in order to deduce the role of Hje and its relationship with the structure-specific endonucleases. We will attempt to purify and characterize proteins that putatively interact with the resolvase by means of affinity purification and mass spectrometry. It is expected that the in vivo functions and a novel regulatory mechanisms of the resolvase will be revealed.

Holliday junction（HJ）是DNA重组修复过程中标志性中间产物，细胞必须对其进行正确加工才能完成染色体的正常复制，保证细胞的存活。HJ解离酶是HJ加工途径中的关键酶，其参与的途径是HJ加工的主要途径之一。细菌中的HJ解离酶RuvC在解旋酶RuvA和RuvB复合体对HJ进行迁移之后对HJ进行解离。近年来古菌和真核生物中也相继发现了HJ解离酶，但其在细胞内的详细作用和调控机制还不十分清楚。本项目拟利用遗传学和转录组学方法，构建基因缺失及回补菌株，检测单基因缺失或与其它结构特异性核酸内切酶基因共缺失对DNA损伤敏感性的影响及引起的转录组变化，分析Hje在DNA损伤修复中的作用及其与这些结构特异性核酸酶的遗传关系。利用亲和纯化和质谱分析方法分离可能与解离酶Hje相互作用的蛋白，鉴定相互作用蛋白的性质和互作机制。预期将揭示和了解古菌解离酶在DNA修复中的作用和新的调控机制。

DNA Holliday junction（HJ）是DNA重组、修复和复制过程中所产生的关键的DNA中间体，细胞必须对其进行加工和处理，以保证遗传信息的正常传递和细胞的生存。古菌是生命的第三域，广泛存在与自然界极端和普通环境中，研究其遗传信息传递机制具有重要意义。本项目利用遗传学、生物化学、结构生物学和组学的方法，以模式古菌冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus REY15A）为材料，全面分析了该菌株中两种HJ DNA 解离酶Hje和Hjc的体内功能和作用机制。主要结论有：（1）硫化叶菌中解离酶基因hje和hjc单独都可以敲除，而双敲除不可；（2）Hje是参与DNA修复的主要的酶，而Hjc可能主要用于处理复制中产生的HJ DNA; （3）一种与Hjc互作的ATP酶和解旋酶PINA（PIN-domain ATPase）与Hjc具有物理上和功能上的相互作用; （4）PINA在古菌中高度保守，在硫化叶菌中不可敲除，其ATP酶活性、与HJ及蛋白因子的结合区域都是必需的;（5）PINA在溶液和晶体中形成六聚体环状结构，其结构可分为PIN、NTPase和KH结构域；（6）除了与Hjc、HJ相互作用外，PINA还与Hjm和RfcS等蛋白相互作用；（7）PINA的C-末端赖氨酸富集区与PINA聚体的形成、与HJ DNA以及Hjm、RfcS蛋白的结合密切关联；（8）Hjc的核酸酶活性受古菌中蛋白激酶磷酸化调控。以上结果已发表于Extremophile （Huang et al., 2015）、J. Mol. Biol. （Zhai et al., 2017）和Nucleic Acids Res.（Zhai et al., 2018）。在本项目的资助下，课题组其它有关古菌DNA代谢和细胞学研究也取得了成果，分别发表于BMC Mol. Biol. （Huang et al., 2015）、Extremophiles （Yan et al., 2016）、Frontiers in Microbiol. （Huang et al., 2017）、Biochem. Biophy. Res. Com. （Yan et al., 2017）、J. Gen. and Genom. （Song et al., 2016）和Mol. Microl.（Liu et al., 2017)等