超嗜热古菌Sulfolobus islandicus核酸切除修复途径研究

核酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)是生物最主要的DNA修复途径之一，人类遗传疾病XP、TTD和CS等都与这一途径的缺陷直接相关。真核生物的NER途径十分复杂，涉及蛋白众多且与转录相偶联，其详细作用机制尚不十分清楚。古菌具有部分真核生物NER途径同源蛋白解旋酶XPB、XPD和核酸酶XPF等,被认为拥有真核生物NER途径原始和简化的模式。古菌中这些同源蛋白的体外生化性质及结构研究已为人类NER蛋白作用机制和疾病发生原因提供了重要启示。然而，目前对古菌该途径所涉及的蛋白及蛋白复合体成分，对其中损伤识别、解链和切割等过程的基本特征和详细机制还很不清楚，相关遗传分析缺乏。本项目拟利用近年来成熟的遗传操作体系，结合生化和结构生物学方法，对硫化叶菌NER途径开展系统深入的研究，揭示古菌该途径的基本特征和机理，为人类NER途径研究和相关疾病分析提供更多的启示。

核酸切除修修复是ＤＮＡ修复主要途径之一，细菌中由UvrABC蛋白完成而真核生物则由转录因子TFIIH完成。古菌中具有真核生物TFIIH部分亚基，包括XPB (XPBI和XPBII)，XPD，Bax1(XPG), 以及XPF但它们在古菌细胞是否具有核酸切除修复功能及其作用机制仍不明了。本研究利用遗传学的方法证明，超嗜热古菌硫化叶菌中虽然存在这些TFIIH蛋白亚基，但它们的缺失对损伤如甲磺酸甲酯处理及UV照射并不十分敏感，表明它们并不直接参与核酸切除修复。XPB1过表达实验分析表明低水平表达对细胞的生长具有促进作用，而大量表达则细胞不能生长,表明XPB1对细胞的生长具有一定调节作用。对核酸酶Bax1, Xpf与Holliday junction 的Hjc及Hje的遗传关系分析显示， 在xpf基础上敲除hjc或hje, 可以解除菌株对损伤剂的敏感性。我们还通过Pull-down的方法，尝试寻找与XPB1 相互作用的蛋白，但没有发现XPB1的互作蛋白。 . 根据以上结果，我们认为由于缺少核酸切除修复中的损伤识别蛋白如UvrA或XpA, 硫化菌中典型的NER损伤并不即可启动这些类似真核生物的蛋白参与的核酸切除修复，而可能由强大的同源重组修复或跨越损伤修复途径来完成。虽然如此，这些蛋白或蛋白复合体如Xpb2-Bax1,对一定类型的损伤具有加工作用。本研究深化了对古菌中核酸切除修复的理解。此外，我们还利用生化及遗传学方法，对重组酶辅助蛋白RadC1和RadC2，以及双链断裂修复蛋白HerA和NurA的体内与体外功能进行了鉴定，加深了对其在DNA 修复中的作用及机制的认识。