Hippo信号通路中Kibra-Merlin复合体的结构与功能研究

Hippo信号通路是近年来研究的一个热点通路，它能够调节细胞大小、器官体积，跟癌症密切相关。Hippo信号通路被激活后通过细胞受体钙粘蛋白Fat介导传递进入到细胞内，经过一系列磷酸化级联反应，将信号传递到细胞核内，调控相关基因的表达。但是膜受体如何将信号传递给细胞内激酶复合物这一机制仍然不清楚。最新文献报道，Kibra参与Hippo信号通路，位于膜相关蛋白Merlin和Expanded上游，并且与Merlin和Expanded相互作用。 本项目拟通过解析Kibra-Merlin蛋白质复合体的晶体结构，结合生物化学，分子生物学，细胞生物学等研究手段，分析Kibra-Merlin复合物的结构与功能，阐明Kibra与Merlin的相互作用关系和介导Hippo信号通路的分子机制。项目的开展将增进对Hippo信号通路在细胞内传递的过程的深入理解，具有重要意义。

本项目主要开展果蝇或人Hippo信号通路中重要复合物Merlin-Kibra的结构与功能研究，其中人源Merlin被称为NF2，Kibra被称为KIBRA。在前期工作中,我们用酵母双杂交实验证明NF2与KIBRA的结合区域主要在KIBRA螺旋区（431-660aa），不能检测到它们与Expanded结合。我们得到了接近全长的NF2（18-595aa）蛋白，筛选和优化出NF2-KIBRA（431-660aa）复合物晶体并解析结构，但是在NF2-KIBRA复合物晶体电子密度图中并没有看见NF2的C端（362-595aa）和KIBRA（431-660aa）氨基酸密度。.项目中期我们调整实验重点，由于NF2在Hippo信号通路中发挥重要作用，自身又是肿瘤抑制因子中“明星”分子。已有文献报道，它的构象变化对于下游信号通路的调节，以及神经胶质瘤的发生和恶化有极其重要的作用。我们利用NF2的N端FERM结构域的三维结构，结合体外pull-down、荧光共振转移（FRET）等实验方法检测了NF2构象变化是如何发生，以及验证磷酸化修饰影响这一变构过程。NF2的N端结构域与模拟磷酸化形式的C端结合非常明显，预示磷酸化的NF2呈闭合构象；而与野生型C端的结合较弱，预示非磷酸化的NF2呈开放构象。与此同时，我们用NF2的全长蛋白、各个截短蛋白以及模拟磷酸化形式蛋白，检测了NF2与CD44胞浆结构域和EBP50结合能力。我们发现单独N端FERM功能域以及模拟磷酸化状态的NF2蛋白不能结合这两个蛋白，而NF2野生型全长蛋白能够结合CD44的胞浆结构域，揭示了开放构象，而不是闭合构象的NF2能够与CD44的胞浆结构域相互作用。这一结果证明了NF2的磷酸化修饰调节其结合CD44的能力，对发挥生物学功能至关重要。上述实验结果说明不同胞外信号通过磷酸化或去磷酸化会调节NF2构象变化，改变它与信号通路下游分子的级联传递，进而产生重要的生物学效应。