Hippo信号通路中蛋白复合物的结构与功能研究及药物先导化合物的筛选

Hippo信号通路是控制细胞大小、器官体积的重要信号通路，与肿瘤的发生密切相关。细胞外信号通过膜蛋白受体介导并经过一系列磷酸激酶级联反应，引起转录激活因子磷酸化从而抑制下游基因的转录。本项目以Hippo信号通路中重要蛋白复合物Fat-Dachsous（胞外配体-受体复合物），Kibra-Merlin-Ex（穿膜信号转导复合物），Wts-Mats（磷酸化激酶复合物），YAP-TEAD（转录因子复合物）为研究对象，综合运用结构生物学，生化和细胞生物学等手段，开展蛋白质复合物的结构与功能研究，在分子水平上，阐明复合物蛋白相互作用关系以及其介导的生物学功能，全面揭示Hippo信号通路从胞外到核内整个信号转导过程的结构基础和分子机制。项目的顺利开展将有助于进一步了解Hippo信号通路成员在肿瘤发生过程中的致病机理，基于结构的小分子抑制剂的设计和筛选也有希望得到抑制肿瘤生长的药物先导化合物。

本项目主要开展Hippo上游信号通路蛋白及蛋白复合物的结构研究，并开展相应的生化分析，揭示Hippo信号通路的调控机制。根据已经获得的YAP-TEAD复合物晶体结构，进行虚拟筛选和小分子抑制剂的设计，争取获得有抑制活性的小分子化合物，为临床应用奠定基础。.项目基本按照原计划进行，获得了Mer（即NF2）的晶体结构，完成了相关的生化分析（文章正在准备投稿）；发现PKC调节Hippo信号通路的分子机制（在Cell Research minor revision）；获得若干对YAP有抑制活性的小分子，基本完成细胞水平的实验，即将进入动物模型实验验证和优化化合物，有望为临床应用奠定基础。取得主要研究成果如下：.1..PKC磷酸化YAP 调节Hippo信号通路.我们的研究发现，TPA等细胞外信号，刺激细胞导致Hippo信号通路中关键蛋白YAP去磷酸化并激活YAP靶基因的表达。进一步的研究发现这些信号是通过激活蛋白激酶PKC，从而引起YAP磷酸化的改变，并且不同亚型的PKC有相反的YAP磷酸化效果。我们已经确定了TPA激活和抑制PKC的不同亚型。这些上游信号通过PKC磷酸化YAP，直接影响YAP的亚细胞定位，及靶基因的表达，以及细胞增殖。.2..NF2的构象变化机制.NF2（果蝇中为Merlin）是重要的肿瘤抑制因子，在Hippo信号通路中发挥重要作用。NF2由N端的FERM结构域和C端的调节结构域组成。我们解析了NF2的N端FERM结构域的晶体结构，并结合生化手段研究了其整体构象变化是由N和C结构域的自身结合完成的。而这种自身结合又受磷酸化所调节从而实现对NF2功能影响。.3..YAP抑制剂的筛选和优化.我们利用荧光偏振技术，从335，000个化合物筛选实验中，获得38个能够有效抑制YAP与TEAD相互结合的化合物。进一步利用细胞内luciferase荧光素酶报告系统，发现其中4个化合物具有较高的抑制活性。经过多轮体内外化合物优化和验证，目前已经获得微摩尔量级抑制活性（细胞水平）的化合物，后续的优化和动物实验工作正在开展。