TET蛋白差异性催化5mC/5hmC/5fC的分子机制研究

Mammalian DNA methylation occurs on the C-5 position of cytosine,which is an important epigenetic modification.TET dioxygenases sequentially oxidize the 5mC into 5hmC and 5fC untill 5caC.The 5caC is finally replaced into cytosine through BER pathway. 5hmC is not only involved in the 5mC oxidation pathway,like 5fC and 5caC,but also an important epigenetic biomarker.TET proteins play significant roles in stem-cell development,whose dysregulation lead to human leukamogenesis. The applicant successfully solved the complex struture of TET2 with 5mC-modified DNA,which reveals the molecular mechanisms of DNA substrate recognition by TET2 (Cell,2013,co-first author).In our following stduies,we found that TET dioxygenases oxidized 5mC-modified DNA substrate more efficiently than 5hmC and 5fC-modified substrates.This phenomenon indicates the biological significance of 5mC sequential oxidization catalyzed by TETs. Based on above results, we intend to solve the complex structure of TET with different modified(5hmC/5fC)DNA.Combinied with computational biology,biochemistry and other techniques,we'll elucidate the molecular mechanisms of TET to differentially catalyze the 5mC/5hmC/5fC modified DNA substrate.The accomplishment of this project will perfect the understanding about the dynamic regulatory mechanisms of DNA methylation,and deepen the knowledge of TET proteins' biological functions for us.

哺乳动物DNA甲基化发生在胞嘧啶第五位碳原子上（5mC），是重要的表观遗传学修饰，TET双加氧酶连续氧化DNA上的5mC成为5hmC、5fC和5caC,最终通过碱基切除修饰机制替换成胞嘧啶。TET蛋白在干细胞发育过程中发挥至关重要的作用，其失调导致多种白血病发生。申请人解析了TET2-DNA复合物的结构，揭示了TET蛋白识别DNA底物的分子机制（Cell，2013，共同第一作者）。后续研究发现TET对5mC和5hmC、5fC构成的DNA的酶活性有明显差异，该现象对研究TET蛋白连续催化5mC氧化有重要意义。 申请人拟解析TET蛋白与（5hmC、5fC）DNA复合物的结构，综合利用计算生物学、生物化学等技术，阐明TET对不同底物酶活性差异的分子机制，项目的完成将完善我们对DNA甲基化动态调控机制的理解，加深我们对TET蛋白生物学功能的认识。

TET双加氧酶通过连续氧化底物，主动去除哺乳动物基因组中5-甲基胞嘧啶（5mC）印记的甲基化修饰。经过中间产物5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC），生成终产物5caC，然后通过胸腺嘧啶DNA糖苷酶（TDG）介导的碱基切除修复机制将5fC或5caC替换成胞嘧啶。TET蛋白在干细胞发育过程中发挥重要功能，尤其TET2蛋白突变或失调能够导致多种白血病发生。.本项目主要研究在氧化过程中，TET2对反应物5mC、中间产物5hmC、5fC酶活差异性的潜在分子机制。通过结构生物学手段，解析出TET2-5hmC-DNA（1.80 Å）和TET2-5fC-DNA（1.97 Å）两种复合物的三维结构，与之前发表的TET2-5mC-DNA结构比较，发现TET2对不同底物酶活差异的原因：.5mC疏水性侧链伸向活性中心，但与辅因子和TET2不发生相互作用，待消去的氢原子没有空间构型限制，容易被TET2蛋白氧化。相反，5hmC的羟甲基与辅因子NOG上1-羧基形成氢键，限制了羟甲基的空间构型。虽然被消去的氢与Fe2+距离为3.74Å，但此距离依赖于辅因子1位羰基，反应伊始2-OG会脱去此羰基，氢与Fe2+的距离会发生变化，不利于5hmC被活性中心催化。5fc通过羰基与胞嘧啶环外的N原子形成分子内氢键，导致反应中间产物5fC朝向活性口袋中心反方向，被氧化的氢原子距离Fe2+相对较远（4.98 Å）。5hmC和5fC都处在不利于TET2蛋白继续氧化脱氢的空间微环境，导致TET2蛋白对这两种中间产物的酶活效率远低于反应物5mC。.DNA甲基化和去甲基化是表观遗传学领域的热点问题，项目的完成将加深我们对TET蛋白介导DNA去甲基化多步氧化反应的理解，完善我们对TET蛋白功能的认识，在蛋白水平解释生物体内5hmC累积这一生命现象。