野生型T4 DNA连接酶提取物中多聚核苷酸磷酸激酶活性的测定

Nicks in DNA double helix can result from DNA replication or DNA damage. These nicks have to be repaired by DNA ligase to maintain normal life activities of a cell. There are two types of DNA nicks: nicks with 5'-P ends and nicks with 5'-OH ends. It is thought that T4 DNA ligase has no an activity of polynucleotide kinase (PNK). Therefore, a nick with a 5'-OH end cannot be joined directly by T4 DNA ligase. This kind of nick has to be phosphorylated by PNK before it can be joined by T4 DNA ligase. However, in our previous investigations, we found that the 5'-OH ends of some oligonucleotides could also be phosphorylated by a commercial T4 DNA ligase. To explore whether a 5'-OH end can also be phosphorylated by a wild-type T4 DNA ligase, we are going to prepare wild-type and mutated T4 DNA ligases by using molecular cloning techniques. These T4 DNA ligases will be used in the phosphorylation of 5'-OH ends of oligonucleotides. Based on the results of phosphorylation catalyzed by the wild-type and the mutated T4 DNA ligases, we can determine whether or not a wild-type T4 DNA ligase has a PNK activity. If it can be confirmed by our experiments that a wild-type T4 DNA ligase has a PNK activity, it may mean that some DNA nicks with 5'-OH ends can be repaired by T4 DNA ligase alone. We think that the PNK activity from T4 DNA ligase, despite its low efficiency, is important for the repair of DNA nicks with 5'-OH ends in the absence of PNK.

一般认为DNA双链上的5'-羟基末端缺口必须经过多聚核苷酸磷酸激酶（PNK）磷酸化之后，才能被T4 DNA连接酶修复。然而，我们在前期研究中发现，商品化的T4 DNA连接酶也具有微弱的PNK活性，可以将少量寡核苷酸的5'-羟基末端磷酸化。为了探讨野生型T4 DNA连接酶是否也具有这种PNK活性，本项目拟应用分子克隆技术制备野生型和突变型的T4 DNA连接酶，并用于寡核苷酸5'-羟基末端的磷酸化等实验。根据野生型及突变型T4 DNA连接酶催化的磷酸化反应等实验结果，最终确定野生型的T4 DNA连接酶有无PNK活性。如果野生型T4 DNA连接酶的PNK活性获得确认，则可能提示DNA双链上的某些5'-羟基末端缺口可以由T4 DNA连接酶独立修复。尽管其效率不高，但在PNK缺乏的情况下，这种T4 DNA连接酶本身所具有的PNK活性对于DNA 5'-羟基末端缺口的修复具有重要意义。

我们在前期研究中发现，商品化的T4 DNA连接酶具有微弱的多聚核苷酸磷酸激酶（PNK）活性，能将少量寡核苷酸的5'-羟基末端磷酸化。为了探讨野生型T4 DNA连接酶是否具有PNK活性，本课题拟应用分子克隆等技术制备野生型和突变型的T4 DNA连接酶，并用于寡核苷酸5'-羟基末端的磷酸化实验。根据野生型及突变型T4 DNA连接酶催化寡核苷酸5'-羟基末端磷酸化的实验结果，最终确定野生型T4 DNA连接酶有无PNK活性。但由于放射性同位素的购买及运输受到严格管控，使本课题组一直不能获得用于检测野生型T4 DNA连接酶提取物中PNK活性的放射性同位素32P，因此，我们只能停止这方面的研究。而另一方面，我们在前期研究商品化T4 DNA连接酶PNK活性的过程中，发现了某些寡核苷酸不能被银染色，因此我们将本课题的重点转向研究这一现象发生的原因，取得了以下发现：1.寡核苷酸(dA)、(dC)、(dG)和(dT)在聚丙烯胺凝胶中对银染色的敏感性从高到低依次为(dA) > (dG) > (dC) > (dT)。含有T碱基的寡核苷酸的银染色可以被T碱基部分甚至完全抑制，这种抑制受到嗜银碱基和T碱基的相对数量、嗜银碱基与T碱基的顺式距离和聚丙烯酰胺凝胶浓度的影响；2.寡核苷酸碱基改变对寡核苷酸的银染色及花青素染色的影响具有累积效应，当寡核苷酸的碱基改变累积到一定程度时寡核苷酸对银染色或花青素染色的敏感度就有可能突然出现显著变化；3.银和花青素对寡核苷酸的染色具有部分互补性，即，对银染色不敏感的寡核苷酸可能会对花青素敏感，或反过来。但相对于其它碱基组成的寡核苷酸，由C和T两种碱基共同组成的寡核苷酸对银染色或花青素染色的敏感度都较低；4.寡核苷酸(A8)、(C8)、(G5)和(T8)在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率由高到低依次为(C8) > (A8) > (T8) > (G5)。碱基G是降低迁移率的主要碱基；5.用甲醇固定液固定聚丙烯酰胺凝胶可以提高短链寡核苷酸对花青素染色的敏感度250倍左右。