miR156-MsSPL4调控紫花苜蓿分枝发育的分子机制

As one of the critical yield components, it is undoubted that researches on shoot branching related genes and their regulatory mechanism will provide remarkable insight for understanding the genetic basis of yield and the following alfalfa breeding. SPL gene family belongs to the plant-specific transcription factor, which proved to control shoot branching (tillering) in plant. In the present research, we focus on the molecular mechanism of shoot branching regulated by miR156-MsSPL4 in alfalfa. To hit the mark of this study, three sections will be accomplished independently as well as integrally. ① The SPL gene family will be systematically analyzed through bioinformatic. Temporal and spatial expression model of SPL genes will be investigated and the key gene MsSPL4 which regulated by miR156 will be selected as our target. ② Transgenic alfalfa overexpressing and silencing MsSPL4 will be phenotyped to clarity its biological functions. ③ Genes involved in MsSPL4 regulatory network will be identified through Y2H and RNA-seq, and verified by BiFC, Y1H and EMSA. We will also measure the transcript levels of those genes in transgenic alfalfa to elucidate the regulatory model of MsSPL4 in shoot branching. This research will establish the molecular mechanism of shoot branching regulated by miR156-MsSPL4 in alfalfa as well as provide candidate gene and germplasm resources for alfalfa high yield breeding.

分枝数是决定紫花苜蓿产量的关键因素，挖掘与分枝相关的基因并研究其作用机理对于解析紫花苜蓿分枝性状的遗传构成、提高产量具有重要意义。SPL基因是植物特有的一类转录因子，能够直接调控植物的分枝发育。本研究拟以紫花苜蓿SPL基因为切入点，采用生物信息学、遗传学及分子生物学的手段重点研究：①紫花苜蓿SPL基因家族的系统分析，明确SPL基因的时空表达模式，筛选出在分枝发育中具关键作用的miR156靶基因MsSPL4，并分析其转录因子特性；②获得MsSPL4过表达及沉默的转基因紫花苜蓿并分析表型，明确MsSPL4的生物学功能，探讨其在育种中的应用；③筛选并验证MsSPL4的上下游作用因子，调查转基因植株中各作用因子的转录水平变化，揭示MsSPL4作用的分子机制。预期结果将在理论上揭示miR156-MsSPL4调控紫花苜蓿分枝发育的分子机制，在生产上为紫花苜蓿多分枝高产育种提供优异的候选基因及种质资源。

SPL基因是植物中关键的一类转录因子，被证实参与植物的多种发育进程。对这类转录因子的研究表明其在作物重要性状改良中具有重要潜力，尤其对于株型、分枝、开花期、产量、籽粒大小等性状的改良较为显著。紫花苜蓿的开花时间对于紫花苜蓿的产量及品质具有较大影响。开花时间也常作为农户收割紫花苜蓿的标志，初花期是紫花苜蓿适当的收割时间，在合适的时间收割能够平衡紫花苜蓿品质、产量以及田间留茬的再生能力。因此，发掘及研究影响紫花苜蓿开花时间的关键基因，对于提高紫花苜蓿的产量及品质具有重要价值。.本研究利用生物信息学手段挖掘紫花苜蓿基因组中的SPL基因，发现紫花苜蓿包含22个非冗余的SPL基因；系统进化分析表明SPL基因起源于单双子叶分化之前，随着物种的分化而分别进化，紫花苜蓿中的SPL基因可能存在基因复制及功能分化。采用5’-RLM-RACE的方法探究紫花苜蓿中受到miR156调控的MsSPL基因，结果发现11个MsSPL基因能够被miR156降解；进一步对MsSPL基因在紫花苜蓿中的时空表达进行调查，发现MsSPL基因在22个紫花苜蓿组织中的表达模式较为丰富，其中MsSPL20作为紫花苜蓿特异的SPL基因在花序的发育中表达丰度较高，可能参与紫花苜蓿开花期的调控。.以MsSPL20为候选基因进行转基因验证发现，转基因株系相较对照表现出稳定为5-10天的开花延迟，生物量比对照增加20%，而品质则没有显著性的变化。后续的RAN-seq试验发现，相较对照植株，转基因植株中有471个基因的表达量发生了显著变化，差异表达基因主要富集于发育过程、细胞组成成分、花粉发育以及配子体发育等过程。进一步的分析发现有38个差异表达基因与花的发育相关，且其启动子区包含与SBP结合的GTAC元件4-9个。推测MsSPL20通过抑制成花素及其运输基因的表达，或是上调成花素抑制基因的表达，抑制成花素的形成，从而延迟紫花苜蓿的花发育，进而延迟开花。