Wnt信号对前脑腹侧神经前体细胞命运决定的体内体外机制研究

Signaling pathway and transcription factor finally determine lineage fate of neural cell during development of nervous system. Previous studies showed that Wnt and Shh signaling regulated the developments of dorsal and ventral forebrain, respectively. However, currently, we found that mice with conditional knockout of Wnt signaling in ventral forebrain neural progenitors were lethal during prenatal and postnatal developments. This fact indicates Wnt signaling, cooperating with Shh, plays key roles in differentiation of ventral forebrain neural progenitors, however, the mechanism is unclear. Thus, from the perspective of in vivo embryonic development, this study will research the mechanism of Wnt signaling on differentiation of ventral forebrain neural progenitors by using conditional knockout mice expressing YFP. On the other hand, we are going to ensure the regular effects of Wnt signaling in lineage fate determination of ventral forebrain neural progenitors. And we expect to optimize the method how to target human embryonic stem cells to ventral forebrain neural progenitors and certain mature neuron by using the in vitro neural differentiation system. These differentiated cells will subsequently be characterized for their functional effects, providing evidence for cell replacement therapy of certain diseases.

在神经系统的发育过程中，信号分子与转录因子共同决定神经细胞的分化发育类型。虽然前期研究发现Wnt和Shh这两大拮抗信号分别调控前脑背侧和腹侧的发育，但是我们最近发现在前脑腹侧神经细胞中条件性敲除Wnt信号的小鼠在出生前后死亡。这个事实说明，Wnt可以协同Shh信号对前脑腹侧神经细胞的后续分化发育具有重要作用，但是具体调控机制并不清楚。本申请拟从体内胚胎发育的角度，利用YFP报告基因标记的条件性敲除Wnt信号的转基因小鼠，追踪前脑腹侧神经细胞的生成命运，并进一步阐明Wnt信号对其的调控机制。另外，从体外神经分化的角度，利用人胚胎干细胞神经定向分化的系统，我们将根据Wnt信号对前脑腹侧神经细胞生成的调控作用，研究如何将人胚胎干细胞分化为前脑腹侧神经前体细胞，以及进一步分化为被Wnt信号调控的特异类型的神经细胞。同时初步评判分化神经细胞的体外功能活性，为细胞替代治疗某些特定疾病奠定基础。

信号与转录因子是多能性干细胞分化过程中细胞命运决定的两大关键因素。但是人胚胎干细胞神经定向分化过程中通过区域化产生前脑腹侧特异性神经前体细胞的具体调控信号和转录网络却不是十分清楚。有报道指出Wnt和Shh这两大拮抗信号分别调控前脑背侧和腹侧的生长发育，但是我们的前期研究发现绝大部分在前脑腹侧神经前体细胞中条件性敲除Wnt信号的小鼠在出生前后死亡。因此，本项目旨在研究Wnt是否可以协同Shh信号对前脑腹侧神经细胞的分化发育进行调控。首先从体内胚胎发育的角度，利用YFP报告基因标记的条件性敲除Wnt信号的转基因小鼠，结合RNA-seq生物信息分析，我们发现在前脑腹侧神经前体细胞中敲除Wnt信号阻碍神经前体细胞的增殖，促使神经细胞提前发育，但是阻滞神经元成熟。另一方面，从体外神经分化的角度，利用人胚胎干细胞神经定向分化系统和RNA-seq分析，我们进一步验证了体内研究的结果。通过把敲除或过表达Wnt信号的人胚胎干细胞神经定向分化，我们发现Wnt信号并不影响神经外胚层的发育，但是对腹侧神经前体细胞的生长发育具有调控作用，表现为敲除Wnt信号的腹侧神经前体细胞提前表达神经特异性基因，伴随增殖能力减弱，而过表达Wnt信号的神经前体细胞增殖能力增强，神经分化受损。基于这个结论，我们在前脑腹侧神经前体细胞阶段长时间地持续激活Wnt信号，不仅能够延长获得神经前体细胞的时间窗口，而且能更多地获得前体细胞以及后续分化的具有生理活性的特异类型的神经细胞。这是多能性干细胞神经定向分化系统创新性的发展，也为细胞替代治疗某些特定疾病提供了更加可靠的手段。