中华绒螯蟹整合素及其介导的免疫应答机制研究

Integrins are a superfamily of cell surface adhesion receptors, which can mediate adhesion reaction functioning in innate immunity and development through binding with corresponding ligands. In present project, techniques in bioinformatics, molecular biology and immunology will be used to (1) clone the full-length cDNA of α-integrin and β-integrin from Chinese mittern crab , eriocheir sinensis and analyze their phylogenetic relationship; (2) investigate the expression pattern of the integrins after crabs are stimulated by microorganisms or cytokines; (3).recombine the integrins and examine the immune functions they performed; (4) interference the expression of the genes and reveal their roles in immune defense against pathogens; and (5) unveil the binding mechanism between integrin and its major ligand - RGD. The present project will provide useful evidence for understanding the function and mechanism of crustacean integrins, and shed new insight and theory into marine invertebrate immunology.

整合素integrin是细胞表面黏附受体的超家族，可通过与相应配体结合，介导一系列黏附反应，从而在发育和免疫系统中行使一定的功能。本项目拟采用生物信息学、分子生物学和免疫学技术，从中华绒螯蟹中克隆integrin基因α和β亚基，进行系统进化分析；在个体水平研究这些基因在不同类型病菌及细胞因子刺激下的表达特征；体外重组integrin，确定其表达产物的免疫学功能；通过沉默integrin在体内的表达，明确integrin在中华绒螯蟹抵御病原微生物侵袭中的作用；探讨integrin和其主要配体结构RGD的结合机制。该项目将为系统深入了解甲壳动物integrin的功能和作用机制提供有力依据，并为丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供新的思路和理论支持。

细胞黏附分子整合素家族（integrin）是一组二价阳离子依赖性的跨膜细胞表面糖蛋白，在发育和免疫系统中行使一定的功能。为了明确中华绒螯蟹的免疫系统和防御结构与整合素的关系，本项目采用同源克隆和RACE相结合的方法，从中华绒螯蟹中克隆integrin基因α和β亚基，进行系统进化分析; Real-time PCR方法研究其组织表达水平及在不同病菌刺激下的表达特征;体外重组integrin，确定其表达产物的免疫学功能;通过沉默integrin在体内的表达，明确integrin在中华绒螯蟹抵御病原微生物侵袭中的作用。结果发现，中华绒螯蟹α-integrin基因全长4661 bp，编码1108 aa，为2次跨膜蛋白（transmembrane region），未发现信号肽，具有典型的α亚型整合素功能区。β-integrin基因全长cDNA长为3518 bp，编码775 aa，其功能域包括信号肽、INB（整合素β亚基B结构域），EGF（表皮生长因子），为1次跨膜蛋白。荧光实时定量PCR结果表明，中华绒螯蟹integrin的mRNA在各组织中均有表达，其中在肌肉中的表达量最高，在肝脏和血液中的表达量次之。嗜水气单胞菌、鳗弧菌和酵母菌的刺激均可使中华绒螯蟹血细胞中integrin的mRNA表达量显著升高。酶切法原核重组2种integrin亚基均能不同程度地促进中华绒螯蟹血细胞的包囊化及吞噬率，另外对藤黄微球菌和嗜水气单胞菌具有显著的抑制作用。采用dsRNA注射的方法对β-integrin基因进行干扰后发现中华绒螯蟹吞噬率及血细胞数目均出现明显下降，对干扰后48 h的中华绒螯蟹进行嗜水气单胞菌的攻毒实验，发现其死亡率较对照组明显上升。以上结果说明integrin在中华绒螯蟹抵抗病原微生物的侵袭中具有一定的作用。该项目为系统深入了解甲壳动物integrin的功能和分工提供有力依据，为进一步揭示水生甲壳动物integrin介导的免疫应答机制、丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供新的思路和理论支持。